Para la investigación se utilizaron los datos de un experimento desarrollado en el Departamento de Ciencias Biofisiológicas, del Instituto de Ciencia Animal. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de diferentes variedades de Moringa oleifera y Cynodon nleumfuensis (pasto estrella) en la población microbiana ruminal, para lo que se midieron las variables bacterias totales y ácido isovalérico. El experimento se conformó en un diseño completamente aleatorizado, con arreglo factorial 6 x 3. Los factores fueron las seis variedades de pastos y los tres horarios, con seis repeticiones cada uno. Las mediciones no se realizaron sobre la misma unidad experimental. Los modelos estadísticos que se utilizaron fueron los siguientes:

Modelo lineal generalizado mixto:

E ( y ) =   μ =   g − 1 ( X β )

Modelo lineal mixto.

y i j =   =   µ   +   α i +   β j +   α   β i j +   e i j

Se verificaron los supuestos teóricos del análisis de varianza para las variables originales. Para la homogeneidad de varianza de los tratamientos, se usó la dócima de Levene (1960). La normalidad de los errores se evaluó mediante la dócima de Shapiro-Wilk (1965). En este análisis, la variable bacterias totales incumplió con ambos supuestos, y después de transformada no mejoró su cumplimiento. La variable original ácido isovalérico sí cumplió con estos supuestos, por lo que no fue necesario realizar la transformación de los datos.

Para la variable que incumplió con los supuestos teóricos de análisis de varianza, se aplicó como alternativa de análisis el modelo lineal generalizado mixto, con ayuda del procedimiento GLIMMIX. Cuando se cumplieron los supuestos teóricos del análisis de varianza, se utilizó el modelo lineal mixto, con ayuda del PROC MIXED, ambos del SAS. En los análisis estadísticos se consideraron como efectos fijos los tratamientos, las horas y la interacción tratamientos por horas. Como efecto aleatorio se consideró la repetición anidada dentro de horas. Para la variable bacterias totales, se probaron las distribuciones normal, Poisson, lognormal y gamma, siendo esta última la de mejor ajuste, con función de enlace log.

Se probaron las estructuras de varianza-covarianza Toeplitz (Toep), componente de varianza (VC), simetría compuesta (CS), autoregresiva de orden 1 (AR[1]) y no estructurada (UN). Para seleccionar la de mejor ajuste a los datos, se utilizaron los criterios de información [Akaike (AIC), Akaike corregido (AICC) y Bayesiano (BIC)], que se consideró el valor más pequeño. Para la comparación de medias, se utilizó la dócima de rango fijo (Kramer 1956). Los datos se analizaron con el paquete estadístico SAS (2013), versión 9.3.

En la tabla 1 se muestra el análisis de los supuestos teóricos normalidad de los errores y homogeneidad de varianza para las variables que se analizaron. Se observó que para las bacterias totales, los valores de probabilidad en ambas dócimas fueron menores que 0.05, por lo que se incumplen dichos supuestos. Sin embargo, para el ácido isovalérico este valor fue superior a 0.05. Esto evidencia el cumplimiento de las hipótesis de bases que sustentan el análisis de varianza.

Tabla 1

Variables	Supuestos teóricos del ANAVA	Dócimas estadísticas	Valor P
Bacterias totales, 1011UFC/ml	Homogeneidad de varianza	Levene	0.0266
	Normalidad de los errores	Shapiro-Wilk	0.0303
Ácido isovalérico, mmol/l	Homogeneidad de varianza	Levene	0.3513
	Normalidad de los errores	Shapiro-Wilk	0.2033

Steel y Torrie (1992) y Peña (1994) señalan que la distribución normal de los errores tiene poca influencia en el ANAVA para comparar medias, ya que esta técnica es robusta ante las desviaciones de los errores. Sin embargo, plantean que la falta de normalidad puede afectar otros supuestos, como la homogeneidad de varianza, y esto sucede sobre todo, cuando el número de observaciones de los grupos son muy diferentes. No obstante, cuando se analizan componentes de varianza, la normalidad sí puede afectar el resultado del análisis.

Según Gutiérrez y de la Vara (2012), la homogeneidad de varianza es un supuesto que relaciona los residuos de los tratamientos, y ofrece una visión general de la posible igualdad entre ellos. Para su análisis se utilizan las dócimas de Levene, Bartlett, Hartley, entre otras. Sin embargo, la de Levene es más robusta ante la falta de normalidad.

Al realizar el análisis para las variables en estudio, se observó que las bacterias totales no cumplieron con la homogeneidad de varianza de los residuos. Peña et al. (2015) plantean que, de acuerdo con la naturaleza de este tipo de variable, no se recomienda el uso de los métodos estadísticos clásicos, debido a que en algunos casos el supuesto de la homogeneidad no se cumple.

Resulta necesario verificar el cumplimiento de los supuestos teóricos de los métodos estadísticos clásicos antes de iniciar el análisis estadístico para este tipo de investigación, pues de acuerdo con los resultados que se obtienen se define la selección del método estadístico apropiado. El empleo de estos modelos estadísticos también evita todos los inconvenientes que pueden incidir en los resultados esperados. Además, este tipo de modelo no requiere del cumplimiento de dichos supuestos, y estos dejan de ser un problema para el análisis de los datos.

La tabla 2 muestra el análisis de las estructuras de varianza y covarianza con el objetivo de seleccionar el modelo de mejor ajuste. Para ello se consideraron los criterios de información. Para la variable bacterias totales, el valor más pequeño se obtuvo con la de componentes de la varianza (VC), y para el ácido isovalérico la autoregresiva de orden uno (AR(1)). Sin embargo, las estructuras simetría compuesta (CS), no estructurada (UN) y la Toeplitz, no lograron la convergencia, y no se ajustaron a los datos analizados. Es por ello que no se informan los resultados para esas estructuras. Sin embargo, Gómez (2019) plantea que para la selección de la estructura de mejor ajuste a los datos se debe tener en cuenta aquella que presenta los valores más pequeños en los criterios de información.

Tabla 2

Variables	Estructuras de covarianza	Criterios de información
		AIC	AICC	BIC
Bacterias totales, 1011 UFC/ml	Toep	775.93	815.11	807.98
	VC	742.77	752.77	760.58
	CS	-	-	-
	AR(1)	744.77	755.90	763.47
	UN	-	-	-
Ácido isovalérico, mmol/l	Toep	-	-	-
	VC	250.5	260.2	268.3
	CS	-	-	-
	AR(1)	249.1	259.8	267.8
	UN	-	-	-

UFC: Unidades formadoras de colonias

Valdivieso (2013) plantea que para modelar las estructuras de covarianza se dispone de datos, en los que las varianzas-covarianzas muestrales de las variables observadas estiman los parámetros del modelo y sus errores. Liscano y Ortiz (2017) informan que si se sospecha la existencia de una estructura que se adecue a los datos, su utilización conduce a una estimación e inferencia más eficiente.

En los resultados de la tabla del análisis de varianza, se muestra que el cuadrado medio del error fue menor, cuando se usaron los procedimientos mixtos. Esto puede estar dado porque, cuando se anidan los efectos dentro del análisis, disminuye la variabilidad de los tratamientos y se logran mejores estimaciones (tabla 3). Hernández et al. (2003) refieren que, cuando se habla de estructura anidada, y los datos están agrupados en unidades experimentales de diverso orden, cada una con propiedades específicas según el nivel de agrupamiento considerado, es necesario eliminar ese efecto para que no incida en la estimación de los resultados.

Tabla 3

Variables	Análisis estadístico	Cuadrado medio del error	Valor de probabilidad Tipo I
Bacterias totales, 1011 UFC/ml	ANAVA	0.3712	<0.0001
	GLMMIX	0.2719	<0.0001
Ácido isovalérico mmol/l	ANAVA	0.4951	0.4046
	MIXED	0.3824	0.2122

UFC: Unidades formadoras de colonias

Los modelos lineales generalizados mixtos y los mixtos aditivos generalizados se usan para modelar los datos anidados y estructuras de correlación espacial y temporal en datos de conteo o datos binomiales. Los de efectos mixtos aditivos y los modelos de efectos mixtos son útiles para datos anidados (llamados también datos de panel o datos jerárquicos), mediciones repetidas y datos correlacionados, temporal y espacialmente (Zuur et al. 2009).

En la tabla 4 se muestran los resultados de la interacción para el análisis de varianza clásico y del modelo lineal generalizado mixto. En ambos casos, la interacción fue significativa. Sin embargo, el error estándar resultó menor cuando se empleó este último. En el análisis se evidenció que el modelo lineal generalizado mixto, en algunos de los casos, fue más conservador para encontrar grupos similares.

Al comparar ambos modelos, algunos de los valores de las medias de los tratamientos que corresponden al modelo lineal generalizado mixto tuvieron ligero incremento. Esto se pudiera relacionar con el ajuste de la función de enlace que se selecciona de acuerdo con la distribución que sigue la variable, por lo que las medias se estiman por el efecto de dicha función de enlace.

Tabla 4

Variable	Análisis estadístico	Hora / Tratamiento	1	2	3	EE Signf.
Bacterias totales viables, 1011UFC/ml	ANAVA	Pasto estrella	2.80abcde (18.71)	2.29abcdef (11.71)	1.18f (4.71)	±0.31 P<0.0001
		Superganius	1.96bcdef (8.04)	1.70cdef (5.54)	2.49abcdef (16.54)
		Tunera	3.04abcd (26.21)	2.57abcdef (16.71)	2.22abcdef (10.04)
		Camerún	3.64a (43.21)	3.17abc (24.71)	1.46ef (7.04)
		Paraguaya	2.51abcdef (13.04)	3.41ab (31.71)	1.59ef (7.21)
		Planin	2.59abcdef (17.21)	3.09abcd (23.21)	2.84abcde (19.71)
	GLMMIX	Pasto estrella	2.93abcde (18.71)	2.43 bcdef (11.71)	1.55 f (4.71)	±0.24 P<0.0001
		Superganius	2.08 cdef (8.04)	1.71 ef (5.54)	2.81abcde (16.55)
		Tunera	3.27abc (26.20)	2.82abcde (16.33)	2.31 bcdef (10.04)
		Camerún	3.77 a (43.23)	3.21abc (24.71)	1.95 def (7.03)
		Paraguaya	2.57 abcdef (13.04)	3.46 ab (31.72)	1.98 def (7.21)
		Planin	2.85 abcde (17.21)	3.14 abcd (23.20)	2.98 abcd (19.72)

UFC: Unidades formadoras de colonia

Al analizar la variable ácido isovalérico, se observó que la interacción entre los efectos principales fue no significativa, por lo que se informaron los efectos principales (tabla 5 y 6). En el efecto de las variedades, el error estándar para el procedimiento mixto fue ligeramente menor con respecto al análisis de varianza clásico, aunque para ambos no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos (tabla 5).

Tabla 5

Análisis estadístico	Tratamientos / Variable	Pasto estrella	Superganius	Tunera	Camerún	Paraguaya	Planin	EE Signf.
ANAVA	Ácido isovalérico mmol/l	2.01	1.89	1.45	1.89	1.60	1.83	±0.17 P=0.0693
MIXED		2.01	1.89	1.45	1.89	1.60	1.83	±0.15 P=0.0825

En la tabla 6 se informa el efecto de las horas. En ambos métodos, los errores estándar presentaron resultados similares, y no se encontraron diferencias significativas entre los horarios. Por tanto, se puede proponer este tipo de análisis para investigaciones relacionadas con experimentos de microbiología del rumen, siempre y cuando se lleve a cabo un análisis estadístico adecuado, que justifique la utilización de estos métodos.

Tabla 6

Análisis estadístico	Horas / Variable	1	2	3	EE y Signif.
ANAVA	Ácido isovalérico mmol/l	1.73	1.87	1.73	±0.12 P=0.6046
MIXED		1.73	1.87	1.73	±0.12 P=0.5469

Según Gómez et al. (2012) y Dicovskiy y Pedroza (2017), los modelos mixtos son una propuesta de modelación estadística avanzada, que permiten mejorar la calidad del análisis de los factores fijos y factores aleatorios, al modelar la variabilidad aleatoria y la correlación de los errores. Son modelos muy útiles en el análisis de datos desbalanceados, o de datos con algún tipo de estructura jerárquica o de agrupación.

A partir de los resultados de esta investigación, se concluye que los modelos mixtos mejoran la exactitud y precisión de los resultados del análisis. Se obtiene cuadrado medio del error más pequeño, cuando su utilizan los procedimientos mixtos, y los errores estándar disminuyen con respecto al análisis de varianza clásico. Desde esta perspectiva, se proponen estos modelos para el análisis de variables relacionadas con experimentos de conteo en la población microbiana del rumen.