cjas Cuban Journal of Agricultural Science Cuban J. Agric. Sci. 2079-3480 Ediciones ICA 00004 ANIMAL SCIENCE Secondary metabolites, quality indicators and organoleptic characteristics of stems meal from Agave fourcroydes (Henequen) Iser Maidelys 1 Valdivié M. 2 Figueredo Liam 3 Nuñez Ester 3 Más D. 4 Martínez Y. 5 * Universidad de Granma, Carretera de Manzanillo, km 17½. Bayamo, Granma, Cuba. Universidad de Granma Universidad de Granma Bayamo Granma Cuba Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. Instituto de Ciencia Animal Instituto de Ciencia Animal San José de las Lajas Mayabeque Cuba Centro Provincial de Higiene, Epidemiologia y Microbiología, Bayamo, Granma, Cuba, C.P 85100. Centro Provincial de Higiene y Epidemiología Bayamo Centro Provincial de Higiene, Epidemiologia y Microbiología Bayamo Granma 85100 Cuba Laboratorio de Nutrición Animal, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, Querétaro 76230, México. Universidad Autónoma de Querétaro Laboratorio de Nutrición Animal Facultad de Ciencias Naturales Universidad Autónoma de Querétaro Querétaro Mexico Escuela Agrícola Panamericana Zamorano, Valle de Yeguare, San Antonio de Oriente 96, Honduras. Escuela Agrícola Panamericana Zamorano Valle de Yeguare San Antonio de Oriente Honduras Email: ymartinez@zamorano.edu 01 03 2020 03 2020 54 1 25 34 19 07 2019 08 12 2019 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License Abstract

To determine the secondary metabolites, quality indicators and organoleptic characteristics of stems meal from Agave fourcroydes (Henequen) grown in Cuba, five henequen stems, of approximately nine years old, were collected. The meal was stored for six months. The following analyzes were performed in triplicate: phytochemical screening , pH, refractive index, density, acidity, water soluble solids, appearance, dissolution capacity, pulverization degree, color, odor, taste and homogeneous capacity. In the ether extract, coumarins predominated and in the ethanolic extract, the flavonoids and anthocyanidins. In the aqueous extract, alkaloids, saponins, flavonoids, mucilages and reducing carbohydrates had little presence. This plant material has a slightly acidic pH (5.18), 1.33 refractive index, 0.31 g/mL of apparent density, 0.76 % acidity and 1.50 0Brix of water soluble solids. The organoleptic characteristics of stems meal from A. fourcroydes showed good physical appearance, partial dissolution capacity, good pulverization, light beige color, pleasant odor, slightly sweet taste and good homogeneity. According to the obtained results, the stems meal from Agave fourcroydes could be used as a nutraceutical product in the farm animals diets.

 Key words: henequen phytochemical compound physicochemical characteristic nutraceutical Introduction

Modern animal production is characterized by its great productive intensity, which implies that animals are subjected to different stress situations, which cause imbalance in the intestinal microbiota, the development of pathogenic microorganisms, immunosuppression, as well as the inefficient food conversion, high mortality and decrease in zootechnical response (Huang et al. 2018). For the previous reasons, antibiotics have been used for decades as animal growth promoting additives. However, its indiscriminate use causes residual effects on foods, microbial resistance, damage to the gastrointestinal biota, among others (Eng et al. 2015).

Since 2006, in the European Union and in other countries of the world, the use of sub-therapeutic antibiotics was prohibited (Ronquillo and Hernández 2017). The scientific community and the livestock industry study and introduce new safe and harmless additives to improve animals productivity, such as nutraceutical products (Liu et al. 2016). The American Veterinary Council of Nutraceuticals shows that they are products that contain, in an integral, purified or extracted way, compounds necessary for a correct biological development (Telrandhe et al. 2012).

Among the sources with great potential for obtaining nutraceutical additives, there are plants belonging to the Agave genus. Its chemical composition varies according to edaphoclimatic conditions, soil characteristics, among other factors (García et al. 2010). Generally, it is considered that these plants, due to their high concentration of fructans and other chemical substances, have medicinal properties and model the intestinal microflora and immunity, which causes beneficial effects for the production and health of the host (Adhikari and Kim 2017). Its use in the diet, in small concentrations, could improve the biological and health indicators in animals (Iser et al. 2016a and Valdovinos et al. 2019).

Nowadays, nutraceuticals are one of the most studied products from the physical-chemical point of view, especially to comply with international laws, since they must provide temporary stability, reproducibility, quality, safety and efficacy (Spanish Nutraceutical Society 2015). Previous results reported on the chemical-physical composition of stems meal from A. fourcroydes (SMAF) (Iser et al. 2016b). However, there was not information on the phytochemical compounds and the quality and sensory indicators of this natural product. The objective of this study was to determine the secondary metabolites, quality indicators and organoleptic characteristics of the stems meal from Agave fourcroydes (Henequen) grown in Cuba.

 Materials and Methods

Sample preparation. Five henequen stems (A. fourcroydes Lem.) were collected in the early hours of the morning, according to the diagonals method, in the field of the enterprise “Eladio Hernández León”, Matanzas province, Cuba. The average age of these plants was nine years, without inflorescence. This area is characterized by a subtropical climate, Lithosol soil (García-Curbelo et al. 2015) and temperature between 23 and 28 oC (data from Estación Meteorológica “Indio Hatuey”).

The stems of A. fourcroydes had an average weight of 6.39 kg (± 0.32). The outer parts of their bark were stripped with a traditional machete and chopped. The samples were spread on an aluminum tray. Subsequently, they were washed three times with distilled water to remove the greatest amount of impurities.

The drying was carried out first naturally for three days, at room temperature. Then, to obtain a homogeneous drying, they were dried artificially with the help of an oven (WSU 400, Germany), at a temperature of 60°C for 72 h. The samples were milled with a 1 mm diameter sieve, in a hammer mill (Culatte typs MFC), until the final product was obtained, which was stored for six months at room temperature, in fully sealed plastic bags (Mas et al. 2018).

Phytochemical screening. Phytochemical screening was determined according to Payo (2001) methodology. To achieve the highest depletion of the sample, successive extractions with solvents of increasing polarity were performed. A total of 10 g of sample were weighed on an analytical balance (BS 2202S Sartorios, China) and 50 mL of petroleum ether was added. After 48 h, the extract was filtered. To the remainder, 50 mL of 70% ethanol was added to obtain the alcoholic extract and the same was done. 50 mL of distilled water was added and the extraction was performed in an analogous way.

Ultrasound (Ultrasonic Cleaner SB-3200 DTD, China) was applied at 40°C, with a frequency of 40 KHz for two hours, recommended time for optimal extraction (Torres et al. 2014). Secondary metabolites were determined in each extract which, due to their solubility, could be extracted in these solvents.

In the ether extract the tests Mayer (alkaloids), Baljet (coumarins) and Sudan III (fatty acids) were performed. In the ethanolic, Liebermann-Burchard (triterpenes or steroids), foam (saponins), ninhydrin (free amino acids), Mayer (alkaloids), Baljet (coumarins), Fehling (reducing carbohydrates), ferric chloride (phenols and/or tannins), Borntrager (quinones), Shinoda (flavonoids), resins, anthocyanidins were determined, as well as bitter and astringent principles.

In the aqueous extract, the Foam (saponins), Shinoda (flavonoids), Fehling (reducing sugars), Ferric chloride (phenols and/or tannins), Mayer and Wagner (alkaloids), Borntrager (quinones) tests were analyzed. Those of mucilages and bitter and astringent principles were also developed. As a measurement criterion, the crossing system was used to specify the qualification of secondary metabolites.

Quality indicators. In the aqueous extract, the pH was determined in a pH- meter (HANNA 211, Portugal), as described in NC-86-01 (1981). The refractive index was calculated according to WHO Pharm 92.559 (1992) using a refractometer at 200C (ABBE WYA-2S, China). The apparent density was determined in a densimeter at 20°C (TGL 0-12792, Germany) (NC 119: 2001). To specify the acidity, the procedure was according to NC-71: 2000 (2000) and for soluble solids (ABBE WYA-2S, China), in accordance with NC-2173: 2001 (2001).

The phytochemical screening and quality tests of the SMAF were performed in triplicate in the Laboratorio de Productos Naturales belonging to the Centro de Estudio de Química Aplicada, Granma University, Cuba.

Organoleptic characteristics. In addition, in the SMAF was examined the appearance, dissolution capacity, pulverization degree, color, odor, taste and homogeneous capacity, according to the Mendoza and Calvo (2010) methodology.

The organoleptic characteristics of the SMAF were determined in triplicate in the Laboratorio de Química Sanitaria de los Alimentos del Centro Provincial de Higiene, Epidemiología y Microbiología (CPHEM) Granma, Cuba.

Statistical analysis. The data of the SMAF quality indicators were processed using the descriptive statistics module. The mean, standard deviation (SD) and coefficient of variation (CV) were determined. The statistical software SPSS, version 17.0 (2012) was used.

 Results and Discussion

The phytochemical screening of SMAF qualified a great variety of secondary metabolites. The ether extract showed coumarins (++) and fatty acids, but not alkaloids (table 1). In both extracts (aqueous and ethanolic), there were not bitter and astringent principles. However, saponins, reducing sugars, alkaloids and flavonoids were detected. The latter had an abundant presence (++) in the aqueous extract. Also the ethanolic extract revealed anthocyanidins (++), coumarins, free amino acids and phenols and/or tannins, without triterpenes or steroids, quinones and resins. In addition, mucilages were identified in the aqueous extract, without phenols or tannins.

Secondary metabolites are natural non-fibrous substances, generated as a defense mechanism against the attack of molds, bacteria, insects and birds, or in some cases, products of plant metabolism under stress conditions (Zandalinas et al. 2017). Phytochemical studies with Agave spp. qualified various beneficial secondary metabolites in leaves, stems and roots. In the Agave americana and Agave barbadensis, new flavonoid molecules were identified (Tinto et al. 2005) and in the Agave tequilana there were flavonoids and phenolic oxhydryls, without the presence of saponins (Flores and Borredon 2013).

Phytochemical screening of ether, ethanolic and aqueous extracts of the stems meal from <italic>Agave fourcroydes</italic>
Metabolites Extracts
ether ethanolic aqueous
Fatty acids +
Alkaloids (Mayer) - + +
Alkaloids (Wagner) +
Coumarins ++ +
Saponins + +
Flavonoids ++ +
Anthocyanidins ++
Triterpenes or esteroids -
Mucilage +
Reducing carbohydrates + +
Quinones -
Resins -
Free amino acids +
Phenols and/or tannins + -
Bitter and asrigent principles - -

Legend: (-) absence; (+) little presence; (++) abundant presence; control no analysis

Several types of steroidal saponins were also found in the Agave fourcroydes, Agave macroacantha and Agave sisalana (Hamissa et al. 2010), while in the Agave intermixa there was a high presence of polyphenolic compounds (García et al. 1999). In other products rich in fructans, such as yacon (Smallanthus sonchifolius) root, mainly reducing carbohydrates and alkaloids were discovered (de Andrade et al. 2017).

In the scientific literature of animal science, secondary metabolites are considered anti-nutritional factors because they exert effects contrary to what is considered an optimal nutrition of animals, especially due to the decrease in digestive metabolism (Savón et al. 2007). However, it has been shown that these secondary metabolites, in small concentrations in diets, improve nutrient digestibility, immune stability, as well as competitive exclusion of microorganisms and intestinal health (Aroche et al. 2018).

Flavonoids (++) detected by phytochemical screening in SMAF (table 1) constitute polyphenolic compounds that, when they are in small concentrations in diets, are beneficial for their antioxidant effect (free radical capture RH *), anti-inflammatory, antiviral and antiallergic, in addition to influencing on the oxidation of LDL and in the regulation of cell growth (Wang et al. 2018).The anthocyanidins, identified in the SMAF, are water-soluble pigments that are stored in the vacuoles of plant cells. They are in all the organs of the plant and have positive effects on inflammatory states (innate immunity), related to their antioxidant and stimulating capacity of the immune system. The presence of these pigments increases lymphocyte proliferation and cytokine secretion (interleukin II) by the activated lymphocytes (Camacho et al. 2016).

In addition, other secondary metabolites found in SMAF, such as coumarins and reducing carbohydrates, constitute potent anticoagulants and bactericides against strains of Staphylococcus aureus and Escherichia coli (Escalona et al. 2016). The saponins detected, which are glycosides, widely distributed in plants, have antimicrobial and hypocholesterolemic effects (del Hierro et al. 2018). There was not reaction for bitter and astringent principles, although these properties have been related to the stimulation of gastric and bile juices. An excess causes a decrease in voluntary intake and decreases the productive behavior of animals (Han et al. 2018).

The presence of tannins in the SMAF could be beneficial for its antidiarrheal effects and for its performance as growth promoters in farm animals (Martínez et al. 2013). This polyphenolic metabolite has anti-inflammatory, vasoconstrictor, antioxidant, antibacterial and hypocholesterolemic properties (inhibits cholesterol absorption and expels it through faeces). However, excess tannins can limit the absorption of some nutrients, such as iron and proteins, as well as cause adverse intestinal processes (Pathak et al. 2016). Studies with Agave tequilana meal and SMAF as nutraceutical additives in pigs and birds diets positively modified the animal response (Iser et al. 2016a, Iser et al. 2016c and Chávez et al. 2019).

The quality indicators are mainly determined in the phytopharmaceuticals for humans (Shukla et al. 2018). However, although these analyzes are not common in animal foods, their evaluation is considered important. One of the international guidelines of nutraceuticals is the strict control of the quality of these products (Sociedad Española de Nutracéutica 2015), which certifies the high level of safety for their use as an additive in animal feeding.

As table 2 shows, the average pH of SMAF was approximately 5.18. This shows a certain inclination towards acidic compounds, which is due to a close relation with acidity. Madrigal and Sangronis (2007) found similar results when evaluating inulin and oligofructose (5 to 7), with slightly acidic values important for the stabilization and preservation of the product (Martínez et al. 2012).

Quality indicators of the stems meal from <italic>Agave fourcroydes</italic>
Indicators Mean (n=3) SD (±) CV (%)
pH 5.18 0.020 0.386
Acidity (%) 0.76 0.010 1.315
Refractive index 1.33 0.006 0.451
Apparent density (g/mL) 0.31 0.005 1.612
Water soluble solids (0Brix) 1.50 0.021 1.400

SD: standard deviation; CV: coefficient of variation

The refractive index and density constitute quick and simple tests to verify the purity degree and the percentage of solute dissolved in a given solution, as a critical control point (Shin et al. 2018). The refractive index showed an average value of 1.33, similar to other medicinal plants, such as the leaves of Anacardium occidentale (1.34) and Morinda citrifolia (1.35). This analysis in medicinal plants has been related to the greater presence of phytochemical compounds. In this regard, Torrenegra et al. (2015) indicated that a refractive index higher than 1.00 in essential oils of Minthostachys mollis is associated with secondary metabolites such as benzenic, aromatic and oxygenated terpenes. There were no reports that refer this quality parameter in the Agave spp., so this result is considered as a first for the proposed nutraceutical additive.

The low density of SMAF is related to the presentation of the product as meal, with high percent of dry matter (95.24%) (Iser et al. 2016b). The apparent density showed similar levels to those reported by Handreck et al. (2002), who recommend density up to 0.6 g/mL. Sánchez et al. (2015) reported inferior results to this study, when evaluating different agricultural substrates from A. tequilana. A similar response is reported in other organic substrates such as coconut fiber, rice husk and cane bagasse, with 0.077, 0.099 and 0.065 g/mL, respectively (Pire and Pereira 2003). However, the inulin extracted from Achicoria (1.35 g/mL) and Dhalia (1.19 g/mL) have higher apparent density (Campos et al. 2013). This indicator is directly related to the packing volume, which tends to be inversely proportional. In addition, generally, products derived from medicinal plants, such as aqueous extracts, fluids and tinctures, have a higher refractive index 1.00 (Rodríguez et al. 2012).

In relation to the soluble solids in the SMAF, there was a concentration of water-soluble active ingredients similar to Morinda citrifolia (1.57), which is convenient for direct use in diets and/or as phytopharmaceuticals. According to Koteswara et al. (2016), in products with low soluble solids content and high humidity values, the proliferation of pathogens is encouraged. Specifically, SMAF has high dry matter content (95.24 %) (Iser et al. 2016b) and beneficial water-soluble secondary metabolites, such as alkaloids, saponins, flavonoids, mucilages and reducing carbohydrates (table 1). This can positively influence on the quality of SMAF, as a future nutraceutical additive.

Table 3 shows that the organoleptic characteristics of the steams meal from Agave fourcroydes, stored for six months, is among the normal parameters for foods suitable for intake. A homogeneous powder was found, of good physical appearance and pleasant odor, without apparent presence of lumps. According to das Chagas et al. (2015), the lump is a distinctive feature of mycotoxin-contaminated products, which causes significant organoleptic changes.

Organoleptic characteristics of the stems meal from <italic>Agave fourcroydes</italic>
Indicators Stems meal from Agave fourcroydes1
Appearance Good physical appearance (powder)
Dissolution capacity It partially dissolves
Pulverization degree Good pulverization
Color Light beige
Odor Nice characteristic of the product
Taste Moderately sweet
Homogeneous capacity Homogeneous powder

1Professional experts from the Departamento de Química Analítica del Centro Provincial de Higiene y Epidemiología, Granma province, Cuba were used

The partial dilution and the moderately sweet taste of the product (SMAF) may be determined by the presence of fructans (oligofructose) and fructose (Iser et al. 2016b). Madrigal and Sangronis (2007) found that oligofructose has a moderately sweet taste and higher dilution than inulin, with a neutral taste. Also, Silos et al. (2011) reported that aguamiel from A. tequilana showed a sweet and pleasant taste.

In the SMAF there was a light beige color. According to Flores and Borredon (2013), the color depends on the characteristics of the product, these authors found a brown color in the dried Agave bagasse of salmiana species. In general, fructans have a color between white and pale yellow (Madrigal and Sangronis 2007); perhaps other plant nutrients could determine the color of the proposed product.

 Conclusions

In the ether, ethanolic and aqueous extracts of SMAF, flavonoids, tannins, coumarins, anthocyanidins, reducing sugars and saponins predominated. This natural product could be used as a nutraceutical in the farm animals diets, due to the results of pH, acidity, refractive index, soluble solids, apparent density and organoleptic characteristics.

 Acknowledgments

The collaboration of managers and technicians of the Laboratorio de Productos Naturales, from the Centro de Estudio de Química Aplicada, belonging to the Universidad de Granma, Cuba, for the development of this research is appreciated.

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Para determinar los metabolitos secundarios, indicadores de calidad y características organolépticas de la harina de tallos de Agave fourcroydes (Henequén) cultivado en Cuba, se recolectaron cinco tallos de henequén, de aproximadamente nueve años. La harina se almacenó durante seis meses. Se realizaron por triplicado los análisis siguientes: tamizaje fitoquímico, pH, índice de refracción, densidad, acidez, sólidos solubles en agua, aspecto, capacidad de disolución, grado de pulverización, color, olor, sabor y capacidad homogénea. En el extracto etéreo, predominaron las coumarinas y en el etanólico, los flavonoides y antocianidinas. En el extracto acuoso, los alcaloides, saponinas, flavonoides, mucílagos y carbohidratos reductores tuvieron poca presencia. Este material vegetal tiene un pH ligeramente ácido (5.18), 1.33 de índice de refracción, 0.31 g/mL de densidad aparente, 0.76 % de acidez y 1.50 0Brix de sólidos solubles en agua. Las características organolépticas de la harina de tallos de A. fourcroydes revelaron buen aspecto físico, capacidad de disolución parcial, buena pulverización, color beige claro, olor agradable, sabor ligeramente dulce y buena homogeneidad. Según los resultados obtenidos, la harina de tallos del Agave fourcroydes se podría probar como un producto nutracéutico en las dietas de los animales de granja.

Palabras clave: henequén compuesto fitoquímico característica fisicoquímica nutracéutico Introducción

La producción animal moderna se caracteriza por su gran intensidad productiva, lo que implica que los animales estén sometidos a diferentes situaciones de estrés, que provocan el desbalance en la microbiota intestinal, el desarrollo de microorganismos patógenos, la inmunosupresión, así como la ineficiente conversión de los alimentos, alta mortalidad y disminución de la respuesta zootécnica (Huang et al. 2018). Por las razones anteriores, los antibióticos se han utilizado durante décadas como aditivos promotores del crecimiento animal. Sin embargo, su uso indiscriminado provoca efectos residuales en los alimentos, resistencia microbiana, daños en la biota gastrointestinal, entre otros (Eng et al. 2015).

A partir del 2006, en la Unión Europea y en otros países del mundo, se prohibió el uso de antibióticos sub-terapéuticos (Ronquillo y Hernández 2017). La comunidad científica y la industria del sector ganadero estudian e introducen nuevos aditivos seguros e inocuos para mejorar la productividad de los animales, como los productos nutracéuticos (Liu et al. 2016). El Consejo Americano Veterinario de Nutracéutica señala que son productos que contienen, de forma integral, purificada o extraída, compuestos necesarios para un correcto desarrollo biológico (Telrandhe et al. 2012).

Entre las fuentes con grandes potencialidades para la obtención de los aditivos nutracéuticos, se encuentran las plantas pertenecientes al género Agave. Su composición química varía según las condiciones edafoclimáticas, características de los suelos, entre otros factores (García et al. 2010). Generalmente, se considera que estas plantas, por su alta concentración de fructanos y otras sustancias químicas, poseen propiedades medicinales y modelan la microflora intestinal y la inmunidad, lo que provoca efectos beneficiosos para la producción y salud del huésped (Adhikari y Kim 2017). Su uso en la dieta, en pequeñas concentraciones, podría mejorar los indicadores biológicos y de salud en los animales (Iser et al. 2016a y Valdovinos et al. 2019).

En la actualidad, los nutracéuticos son uno de los productos más estudiados desde el punto de vista físico-químico, sobre todo para cumplir con las legislaciones internacionales, ya que deben aportar estabilidad temporal, reproducibilidad, calidad, seguridad y eficacia (Sociedad Española de Nutracéutica 2015). Resultados previos informaron sobre la composición química-física de la harina de tallos del Agave fourcroydes (HTAF) (Iser et al. 2016b). Sin embargo, no se encontró información sobre los compuestos fitoquímicos y los indicadores de calidad y sensoriales de este producto natural. El objetivo de este trabajo fue determinar los metabolitos secundarios, indicadores de calidad y características organolépticas de la harina de tallos de Agave fourcroydes (Henequén) cultivado en Cuba.

Materiales y Métodos

Preparación de la muestra. Se recolectaron cinco tallos de henequén (A. fourcroydes Lem.) en las primeras horas de la mañana, según el método de las diagonales, en el campo de la empresa “Eladio Hernández León”, provincia de Matanzas, Cuba. La edad promedio de estas plantas era de nueve años, sin inflorescencia. Esta zona se caracteriza por un clima subtropical, suelo Lithosol (García-Curbelo et al. 2015) y temperatura entre 23 y 28 o C (datos de la Estación Meteorológica “Indio Hatuey”).

Los tallos de A. fourcroydes tuvieron un peso promedio de 6.39 kg (± 0.32). Todos se despojaron de las partes externas de la corteza con un machete tradicional y se trocearon. Las muestras se extendieron en una bandeja de aluminio. Posteriormente, se lavaron tres veces con agua destilada para eliminar la mayor cantidad de impurezas.

El secado se efectuó primeramente de forma natural durante tres días, a temperatura ambiente. Luego, para obtener un secado homogéneo, se secaron de forma artificial con la ayuda de una estufa (WSU 400, Alemania), a temperatura de 60 0C durante 72 h. Las muestras se molieron con tamiz de 1 mm de diámetro, en un molino de martillo (Culatte typs MFC), hasta obtener el producto final, que se almacenó durante seis meses a temperatura ambiente, en bolsas de plástico totalmente herméticas (Más et al. 2018).

Tamizaje fitoquímico. El tamizaje fitoquímico se determinó según la metodología de Payo (2001). Para lograr el mayor agotamiento de la muestra, se realizaron extracciones sucesivas con solventes de polaridad creciente. Se pesaron 10 g de muestra en una balanza analítica (BS 2202S Sartorios, China) y se adicionaron 50 mL de éter de petróleo. Transcurridas 48 h, se procedió a la filtración del extracto. Al remanente se le adicionaron 50 mL de etanol al 70 % para la obtención del extracto alcohólico y se procedió de igual forma. Se agregaron 50 mL de agua destilada y se realizó la extracción de forma análoga.

Se aplicó ultrasonido (Ultrasonic Cleaner SB-3200 DTD, China) a 40 °C, con frecuencia de 40 KHz durante dos horas, tiempo recomendado para una extracción óptima (Torres et al. 2014). Se determinaron en cada extracto los metabolitos secundarios que, por su solubilidad, se podían extraer en estos solventes.

En el extracto etéreo se hicieron los ensayos Mayer (alcaloides), Baljet (coumarinas) y Sudan III (ácidos grasos). En el etanólico, se determinaron el Liebermann-Burchard (triterpenos o esteroides), espuma (saponinas), ninhidrina (aminoácidos libres), Mayer (alcaloides), Baljet (coumarinas), Fehling (carbohidratos reductores), cloruro férrico (fenoles y/o taninos), Borntrager (quinonas), Shinoda (flavonoides), resinas, antocianidinas, así como los principios amargos y astringentes.

En el extracto acuoso, se analizaron los ensayos Espuma (saponinas), Shinoda (flavonoides), Fehling (azúcares reductores), Cloruro férrico (fenoles y/o taninos), Mayer y Wagner (alcaloides), Borntrager (quinonas). También se desarrollaron los de mucílagos y principios amargos y astringentes. Como criterio de medida, se utilizó el sistema de cruces para especificar la cualificación de los metabolitos secundarios.

Indicadores de calidad. En el extracto acuoso, se determinó el pH en un pH-metro (HANNA 211, Portugal), según lo descrito en la NC-86-01 (1981). El índice de refracción se calculó según WHO Pharm 92.559 (1992) mediante un refractómetro a 20 0C (ABBE WYA-2S, China). La densidad aparente se determinó en un densímetro a 20 0C (TGL 0-12792, Alemania) (NC 119:2001). Para precisar la acidez, se procedió según la NC-71:2000 (2000) y para los sólidos solubles (ABBE WYA-2S, China), de acuerdo con la NC-2173:2001 (2001).

El tamizaje fitoquímico y las pruebas de calidad de HTAF se realizaron por triplicado en el Laboratorio de Productos Naturales, perteneciente al Centro de Estudio de Química Aplicada, Universidad de Granma, Granma, Cuba.

Características organolépticas. Además, en la HTAF se examinó el aspecto, capacidad de disolución, grado de pulverización, color, olor, sabor y capacidad homogénea, de acuerdo con la metodología de Mendoza y Calvo (2010).

Las características organolépticas de la HTAF se determinaron por triplicado en el Laboratorio de Química Sanitaria de los Alimentos del Centro Provincial de Higiene, Epidemiología y Microbiología (CPHEM) de Granma, Cuba.

Análisis estadístico. Los datos de los indicadores de calidad de HTAF se procesaron mediante el módulo de estadística descriptiva. Se determinó la media, desviación estándar (DE) y coeficiente de variación (CV). Se usó el software estadístico SPSS, versión 17.0 (2012).

Resultados y Discusión

El tamizaje fitoquímico de la HTAF cualificó gran variedad de metabolitos secundarios. El extracto etéreo mostró coumarinas (++) y ácidos grasos, no así alcaloides (tabla 1). En ambos extractos (acuoso y etanólico), no se encontraron principios amargos y astringentes. Sin embargo, se detectaron saponinas, azúcares reductores, alcaloides y flavonoides. Este último tuvo presencia abundante (++) en el extracto acuoso. También el extracto etanólico reveló antocianidinas (++), coumarinas, aminoácidos libres y fenoles y/o taninos, sin presencia de triterpenos o esteroides, quinonas y resinas. Además, en el extracto acuoso se identificaron mucilagos, sin fenoles ni taninos.

Los metabolitos secundarios son sustancias naturales no fibrosas, generadas como un mecanismo de defensa ante el ataque de mohos, bacterias, insectos y pájaros, o en algunos casos, productos del metabolismo de las plantas sometidas a condiciones de estrés (Zandalinas et al. 2017). Estudios fitoquímicos con Agave spp. cualificaron diversos metabolitos secundarios benéficos en hojas, tallos y raíces. En el Agave americana y Agave barbadensis, se identificaron nuevas moléculas de flavonoides (Tinto et al. 2005) y en el Agave tequilana se encontraron flavonoides y oxhidrilos fenólicos, sin presencia de saponinas (Flores y Borredon 2013).

Tamizaje fitoquímico de los extractos etéreo, etanólico y acuoso de la harina de tallos de <italic>Agave fourcroydes.</italic>
Metabolitos Extractos
etéreo etanólico acuoso
Ácidos grasos +
Alcaloides (Mayer) - + +
Alcaloides (Wagner) +
Coumarinas ++ +
Saponinas + +
Flavonoides ++ +
Antocianidinas ++
Triterpenos o esteroides -
Mucílagos +
Carbohidratos reductores + +
Quinonas -
Resinas -
Aminoácidos libres +
Fenoles y/o taninos + -
Principios amargos y astringentes - -

(-) ausencia; (+) poca presencia; (++) presencia abundante; blanco no análisis

También se encontraron varios tipos de saponinas esteroidales en el Agave fourcroydes, Agave macroacantha y Agave sisalana (Hamissa et al. 2010), mientras que en el Agave intermixa hubo alta presencia de compuestos polifenólicos (García et al. 1999). En otros productos ricos en fructanos, como la raíz del yacón (Smallanthus sonchifolius), se descubrieron, principalmente, carbohidratos reductores y alcaloides (de Andrade et al. 2017).

En la literatura científica de ciencia animal, los metabolitos secundarios se consideran factores antinutricionales porque ejercen efectos contrarios a lo que se considera una nutrición óptima de los animales, sobre todo por la disminución del metabolismo digestivo (Savón et al. 2007). Sin embargo, se ha demostrado que estos metabolitos secundarios, en pequeñas concentraciones en las dietas, mejoran la digestibilidad de los nutrientes, la estabilidad inmunológica, así como la exclusión competitiva de microorganismos y la salud intestinal (Aroche et al. 2018).

Los flavonoides (++) detectados por tamizaje fitoquímico en la HTAF (tabla 1) constituyen compuestos polifenólicos que, cuando se encuentran en pequeñas concentraciones en las dietas, resultan benéficos por su efecto antioxidante (atrapadora de los radicales libres RH*), antiinflamatorio, antiviral y antialérgico, además de incidir en la oxidación de las LDL y en la regulación del crecimiento celular (Wang et al. 2018). Las antocianidinas, identificadas en el HTAF, son pigmentos hidrosolubles que se almacenan en las vacuolas de las células vegetales. Se encuentran en todos los órganos de la planta y poseen efectos positivos en estados inflamatorios (inmunidad innata), relacionados con su capacidad antioxidante y estimuladora del sistema inmune. La presencia de estos pigmentos incrementa la proliferación de linfocitos y la secreción de citocininas (interleucina II) por los linfocitos activados (Camacho et al. 2016).

Además, otros metabolitos secundarios encontrados en HTAF, como las coumarinas y carbohidratos reductores, constituyen potentes anticoagulantes y bactericidas contra cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli (Escalona et al. 2016). Las saponinas detectadas, que son glicósidos, distribuidas ampliamente en las plantas, poseen efectos antimicrobiano e hipocolesterolémico (del Hierro et al. 2018). No se encontró reacción para los principios amargos y astringentes, aunque estas propiedades se han relacionado con la estimulación de los jugos gástricos y biliares. Un exceso provoca disminución del consumo voluntario y disminuye el comportamiento productivo de los animales (Han et al. 2018).

La presencia de taninos en la HTAF podría ser beneficiosa por sus efectos antidiarreicos y por su desempeño como promotores de crecimiento en animales de granja (Martínez et al. 2013). Este metabolito polifenólico posee propiedades antiinflamatorias, vasoconstrictoras, antioxidantes, antibacterianas e hipocolesterolémicas (inhibe la absorción del colesterol y lo expulsa a través de las heces). Sin embargo, los taninos en exceso pueden limitar la absorción de algunos nutrientes, como hierro y proteínas, así como provocar procesos intestinales adversos (Pathak et al. 2016). Estudios con la harina de Agave de tequilana y HTAF como aditivos nutracéuticos en las dietas de cerdos y aves, modificó positivamente la respuesta animal (Iser et al. 2016a, Iser et al. 2016c y Chávez et al. 2019).

Los indicadores de calidad se determinan, principalmente, en los fitofármacos destinados a los humanos (Shukla et al. 2018). Sin embargo, aunque no son comunes estos análisis en alimentos para animales, se considera importante su evaluación. Una de las directrices internacionales de los nutracéuticos es el control estricto de la calidad de estos productos (Sociedad Española de Nutracéutica 2015), lo que certifica el elevado nivel de seguridad para su empleo como aditivo en la alimentación animal.

Como muestra la tabla 2, el pH promedio de HTAF fue de 5.18, aproximadamente. Esto demuestra cierta inclinación hacia compuestos ácidos, lo que obedece a la estrecha relación con la acidez. Madrigal y Sangronis (2007) encontraron resultados similares al evaluar la inulina y la oligofructosa (5 a 7), con valores ligeramente ácidos importantes para la estabilización y conservación del producto (Martínez et al. 2012).

Indicadores de calidad de la harina de tallos de <italic>Agave fourcroydes</italic>
Indicadores Media (n=3) DE (±) CV (%)
pH 5.18 0.020 0.386
Acidez (%) 0.76 0.010 1.315
Índice de refracción 1.33 0.006 0.451
Densidad aparente (g/mL) 0.31 0.005 1.612
Sólidos solubles en agua (0Brix) 1.50 0.021 1.400

DE: desviación estándar; CV: coeficiente de variación

El índice de refracción y la densidad constituyen pruebas rápidas y simples para verificar el grado de pureza y el porcentaje de soluto disuelto en una determinada solución, como punto crítico de control (Shin et al. 2018). El índice de refracción mostró valor promedio de 1.33, similar a otras plantas medicinales, como las hojas de Anacardium occidentale (1.34) y Morinda citrifolia (1.35). Este análisis en plantas medicinales se ha relacionado a la mayor presencia de compuestos fitoquímicos. Al respecto, Torrenegra et al. (2015) indicaron que un índice de refracción mayor de 1.00 en aceites esenciales de Minthostachys mollis está asociado a metabolitos secundarios como terpenos bencénicos, aromáticos y oxigenados. No se encontraron reportes que refieran este indicador de calidad en los Agave spp., por lo que este resultado se considera como primicia para el aditivo nutracéutico propuesto.

La baja densidad de HTAF está relacionada con la presentación del producto en forma de harina, con alto por ciento de materia seca (95.24%) (Iser et al. 2016b). La densidad aparente mostró tenores similares a los informados por Handreck et al. (2002), quienes recomiendan densidad hasta 0.6 g/mL. Sánchez et al. (2015) informaron resultados inferiores a este estudio, al evaluar diferentes sustratos agrícolas a partir de A. tequilana. Una respuesta similar se informa en otros sustratos orgánicos como la fibra de coco, cascarilla de arroz y bagazo de caña, con 0,077, 0.099 y 0.065 g/mL, respectivamente (Pire y Pereira 2003). Sin embargo, la inulina extraída de la Achicoria (1.35 g/mL) y Dhalia (1.19 g/mL) presentan mayor densidad aparente (Campos et al. 2013). Este indicador está relacionado directamente con el volumen de empacado, lo que tiende a ser inversamente proporcional. Además, por lo general, productos derivados de las plantas medicinales, como extractos acuosos, fluidos y tinturas, tienen un índice de refracción mayor 1.00 (Rodríguez et al. 2012).

En relación con los sólidos solubles en la HTAF, hubo concentración de principios activos solubles en agua similar a la Morinda citrifolia (1.57), lo que es conveniente para su uso directo en las dietas y/o como fitofármacos. Según Koteswara et al. (2016), en los productos con bajos contenidos de sólidos solubles y altos valores de humedad, se propicia la proliferación de patógenos. Específicamente, la HTAF tiene alto contenido de materia seca (95.24%) (Iser et al. 2016b) y metabolitos secundarios benéficos solubles en agua, como alcaloides, saponinas, flavonoides, mucílagos y carbohidratos reductores (tabla 1). Esto puede influir positivamente en la calidad de la HTAF, como futuro aditivo nutracéutico.

La tabla 3 muestra que las características organolépticas de la harina de tallos de Agave fourcroydes, almacenada por seis meses, se encuentra entre los indicadores normales para los alimentos aptos para el consumo. Se encontró un polvo homogéneo, de buen estado físico y olor agradable, sin presencia aparente de grumos. Según das Chagas et al. (2015), el grumo es una característica distintiva de los productos contaminados con micotoxinas, lo que provoca cambios organolépticos significativos.

Características organolépticas de la harina de tallos de <italic>Agave fourcroydes</italic>
Indicadores Harina de tallos de Agave fourcroydes1
Aspecto Buen aspecto físico (polvo)
Capacidad de disolución Se disuelve de forma parcial
Grado de pulverización Buen pulverizado
Color Beige claro
Olor Agradable característico propio del producto
Sabor Moderadamente dulce
Capacidad homogénea Polvo homogéneo

1Se utilizaron expertos profesionales del Departamento de Química Analítica del Centro Provincial de Higiene y Epidemiología, Provincia Granma, Cuba

La dilución parcial y el sabor moderadamente dulce del producto (HTAF) puede estar determinado por la presencia de fructanos (oligofructosa) y fructosa (Iser et al. 2016b). Madrigal y Sangronis (2007) encontraron que la oligofructosa tiene sabor moderadamente dulce y mayor dilución que la inulina, de sabor neutro. También, Silos et al. (2011) informaron que el aguamiel a partir del A. tequilana mostró sabor dulce y agradable.

En la HTAF se encontró un color beige claro. Según Flores y Borredon (2013), el color depende de las características propias del producto, estos autores encontraron una coloración café en el bagazo de Agave seco de la especie salmiana. Por lo general, los fructanos poseen color entre blanco y amarillo pálido (Madrigal y Sangronis 2007), quizás otros nutrientes de la planta podrían determinar el color del producto propuesto.

Conclusiones

En los extractos etéreo, etanólico y acuoso de la HTAF, predominaron los flavonoides, taninos, coumarinas, antocianidinas, azúcares reductores y saponinas. Este producto natural se podría usar como nutracéutico en las dietas de los animales de granja, debido a los resultados de pH, acidez, índice de refracción, sólidos solubles, densidad aparente y características organolépticas.

Agradecimientos

Se agradece la colaboración de directivos y técnicos del Laboratorio de Productos Naturales, del Centro de Estudio de Química Aplicada, perteneciente a la Universidad de Granma, en Cuba, para el desarrollo de esta investigación.