Phytochemical screening of Psidium guajava leaves. To prepare the sample, leaves of 20 Psidium guajava trees were taken, from the Cuban red dwarf variety, with approximately five years old, in Peralejo area Bayamo-Granma, Cuba. This region is characterized by a flat topography and brown carbonate soil. For the collection, the diversity of size, structure and optimal classification of leaves was considered, identified in the Departamento de Botánica, de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Granma.

After collecting, the impurities (mainly dust and dirt) were removed from the leaves and they were dried in the sun for seven days. Then, the leaves were milled until obtaining a 1 mm powder (Martínez et al. 2012aMartínez, Y., Martínez, O., Escalona, A. Soto, F. & Valdivié, M. 2012a. "Composición química y tamizaje fitoquímico del polvo de hojas y retoños del Anacardium occidentale L. (marañón) ". Revista Cubana de Plantas Medicinales, 17(1): 1-10, ISSN: 1028-4796.).

Successive extractions. To achieve the highest depletion of the sample, the successive extraction scheme was used with solvents of increasing polarity: ethanol and water (Fajardo et al. 2018Fajardo, L., Viera, Y, Rosabal, U.M., Rodríguez, S., Guardia, Y. & Morales, G. 2018. "Tamizaje fitoquímico, control de la calidad y actividad antibacteriana del clon UF-650 en extractos de Theobroma cacao L. (cacao) ". Revista Cubana de Plantas Medicinales, 23(1): 1-12, ISSN: 1028-4796.). The dry powder obtained from the guava leaves was taken. Then, 5 g were weighed on an analytical balance (BS 2202S SARTORIUS, China) and 50 mL of 70% ethanol were added to make the alcoholic extract and 50 mL of distilled water to obtain the aqueous extract. Next, the extraction was carried out in a similar way (Más et al. 2017Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, B., Pupo, G., Rosabal, O. & Olmo, G. 2017. "Análisis preliminar de los metabolitos secundarios de polvos mixtos de hojas de plantas medicinales". Revista Cubana de Plantas Medicinales. 22(1): 1-9, ISSN: 1028-4796.).

Phytochemical screening. The phytochemical analyzes were performed on the hydroalcoholic extract, according to the protocol proposed by Mijares et al. (2014)Mijares, M., Torres, E. & Hermosilla, R. 2014. "Tamizaje fitoquímico de los extractos de Faramea occidentalis (L.) A. Rich. (nabaco) ". Revista Cubana de Plantas Medicinales, 19(4): 421-432, ISSN: 1028-4796. and Rodríguez et al. (2018). The tests of resins, Liebermann-Burchard (triterpenes and/or steroids), foam (saponins), ninhydrin (free amino acids), Dragendorff and Mayer (alkaloids), Baljet (coumarins), Fehling (reducing carbohydrates), ferric chloride (phenols or tannins), Borntrager (quinones), Shinoda (flavonoids) and anthocyanidins were tested. The phytochemical characterization was carried out at Centro de Estudio de Química Aplicada (CEQA), from Facultad de Ciencias Técnicas, belonging to Universidad de Granma, Cuba

Experimental location. The in vivo experiment was carried out at the Antonio Maceo poultry farm, in Bayamo, Granma, Cuba. The average relative humidity was 78 %, the average minimum temperature was 26.3 °C and the average maximum was 30.6 °C.

Diets, animals and treatments. A total of 160 White Leghorn L-33 hens, 27 weeks old, were randomly distributed in four treatments and 10 repetitions per treatment during 70 d. The treatments consisted of a control diet (T0) and the addition of 0.5 (T1), 1.0 (T2) and 1.5 % (T3) of Psidium guajava leaf powder. The results of Más et al. (2016)Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Salazar, I., Aroche, R., López, B. & Marcella, D. 2016. "Efecto de la suplementación dietética de polvos de hojas de Psidium guajava y Anacardium occidentale en el comportamiento productivo e incidencia de diarrea de cerdos en pre y post-destete". Revista Computadorizada de Producción Porcina, 23(10): 106-113, ISSN: 1026-9053. and Aroche et al. (2018)Aroche, R., Martínez, Y., Ruan, Z., Guan, G., Waititu, S., Nyachoti, C.M., Más, D. & Shile L. 2018. "Dietary inclusion of a mixed powder of medicinal plant leaves enhances the feed efficiency and immune function in broiler chickens". Journal of Chemistry, 2018, ISSN: 2090-9063, DOI: https://doi.org/10.1155/2018/4073068. to select the addition levels of P. guajava leaf powder were considered. In addition, the same control diet for laying hens was used, applied in a previous experiment (Rosabal et al. 2017Rosabal, O., Martínez, Y. , Rodríguez, R., Pupo, G., Olmo, C. & Más, D. 2017. "Efecto fitobiótico del polvo de hojas de Anacardium occidentale L. en las dietas de gallinas ponedoras". Revista Cubana de Plantas Medicinales , 22(1):30-35, ISSN: 1028-4796.), formulated from corn and soybean cake, as recommended by UECAN (2007)UECAN (Unión de Empresas del Centro Avícola Nacional). 2007. Aportes de los piensos avícolas. Ed. Ministerio de la Agricultura. La Habana, Cuba..

Experimental conditions. The experimental unit consisted of a 40 x 40 cm metal cage, where four hens were housed. The birds received 110 g of food/hen/d. The water was supplied ad libitum through a nipple/cage and 16 hours of lighting were offered each day. The experiment had an adaptation period of 15 days (Martínez et al. 2012bMartínez, Y., Escalona, A., Martínez, O., Olmo, C., Rodríguez, R., Iser, M., Betancur, C., Valdivié, M. & Liu, G. 2012b. "The use of Anacardium occidentale as nutraceutical in hypoprotein diets for laying hens". Cuban Journal of Agricultural Science, 46(4): 395-401, ISSN: 2079-3480.). The experimental birds were not given medicine or therapeutic veterinary attention during the experimental period.

Productive indicators. The initial and final weights of the laying hens were performed individually at 27 and 37 weeks of age on a SARTORIUS digital scale, model BL 1500, with precision ± 0.10 g. The egg weight was weekly carried out: 20 eggs/treatment, between 8:30 and 9:30 a.m. and the average weight was calculated.

For determining laying intensity, total egg production/week/treatment was considered and one egg/d/ housed bird was assumed as 100%. Mass conversion was calculated when considering food intake, egg weight per repetition and number of eggs laid. At the end of the experiment, the viability was also calculated. The percentage of unfit eggs (cracked, without an eggshell and broken) was calculated by the formula: % unfit eggs (UE), %UE = $\frac{\mathrm{U}\mathrm{E}\mathrm{*}100}{\mathrm{f}\mathrm{i}\mathrm{t}\mathrm{}\mathrm{e}\mathrm{g}\mathrm{g}\mathrm{s}}$

External and internal quality of the egg. In week 37, a total of 20 eggs/treatment were sampled to determine the external and internal quality indicators of the egg. The egg weight was determined with an OHAUS® (China) digital scale with a precision of 0.01 g. To calculate the shape index (SI) the formula used was: $SI=\frac{Smalldiameter}{Bigdiameter}100.$

A Russian vernier with ± 0.01 mm precision was used for measuring the eggshell thickness at the egg’s equator and at the upper and lower poles. The shell surface was determined according to Carter (1975)Carter T.C. 1975. "The hen´s egg: Estimation of shell superficial area and egg volume using measurement of fresh egg weight and breadth alone or in combination". British Poultry Science, 16: 541-543, ISSN: 1466-1799, DOI: https://doi.org/10.1080/00071667508416224. formula, where Area= $3.9782*egg weight{ }^{0.7056}.$

The height of the dense white and the yolk was measured with a height gauge, with ± 0.01 mm accuracy. The yolk color was determined by Roche’s range of 15 colors. The records of Haugh units (HU) were calculated by the relation between the egg weight (W) and the height (H) of the dense white using the formula: $HU=100*\text{log}\left(h-1.7W^{0.37}+7.6\right)$ (Rosabal et al. 2017Rosabal, O., Martínez, Y. , Rodríguez, R., Pupo, G., Olmo, C. & Más, D. 2017. "Efecto fitobiótico del polvo de hojas de Anacardium occidentale L. en las dietas de gallinas ponedoras". Revista Cubana de Plantas Medicinales , 22(1):30-35, ISSN: 1028-4796.).

Statistical analysis. The data were processed by analysis of variance (Anova), one-way, in a totally random design. When necessary, Duncan (1955)Duncan, B. 1955. "Multiple ranges and multiple F test". Biometrics, 11(3): 1-42, ISSN: 1541-0420, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478. Test was used to determine the multiple differences between means, according to the SPSS version 23.0 statistical program. The percentage of unfit eggs was analyzed by comparison of proportions using the COMPARPRO 1.0 program (Font et al. 2007Font, H., Noda, A., Torres, V., Herrera, M., Lizazo, D., Sarduy, L. & Rodríguez, L. 2007. COMPARPRO: Comparación de Proporciones, Versión: 1.0. Departamento de Biomatemática, Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.).

The results of the phytochemical screening of Psidium guajava leaf extracts (table 1) show the diversity of secondary metabolites in the hydroalcoholic extract (mainly flavonoids), metabolites responsible for different biological activities when they are used in small concentrations in diets (Salazar et al. 2019Salazar, I., Rodríguez, R. , Betancur, C., Martínez, Y. & Guillaume, J. 2019. "Análisis de los metabolitos secundarios del polvo de hojas de Origanum vulgare y Ficus pandurata". Revista de Producción Animal, 31(2): 1-3, ISSN: 2224-7920. and Martínez et al. 2020Martínez, Y., Más, D., Betancur, C., Gebeyew, K., Adebowale, T., Hussain, T., Lan, W. & Ding, X. 2020. "Role of the phytochemical compounds like modulators on gut microbiota and oxidative stress". Current Pharmaceutical Design, 26(22): 2642-2656, ISSN: 1381-6128, DOI: http://doi.org/10.2174/1381612826666200515132218.). Also, there was not alkaloids, coumarins and resins in the hydroalcoholic extract of P. guajava leaves.

The tannins present in the Psidium guajava leaves have been described by Más et al. (2015)Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Betancur, C. & Rosabal, O. 2015. "Effect of dietary supplementation with Morinda citrifolia on productivity and egg quality of laying hens". Ciencia y Agricultura, 12(2): 7-12, ISSN: 0122-8420, DOI: https://doi.org/10.19053/01228420.4348. and Mapatac (2017)Mapatac, L.C. 2017. "Potency of medicinal leaves in the growth performance of broiler chicks". Recoletos Multidisciplinary Research Journal, 3(1): 197-206, ISSN: 2244-6710, DOI: http://doi.org/10.32871/rmrj1503.01.16. as anti-nutritional factors, when they are in excess in diets or drugs, because they limit the absorption of some nutrients such as iron and amino acids (Sobral-Souza et al. 2019Sobral-Souza, C.E., Silva, A.R., Leite, N.F., Rocha, J.E., Sousa, A.K., Costa, J.G., Menendesm I.R.A., Cunha, F.A.B., Rolim, L.A. & Coutinho, H.D. 2019. "Psidium guajava bioactive product chemical analysis and heavy metal toxicity reduction". Chemosphere, 216(2): 785-793, ISSN: 0045-6535, DOI: https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2018.10.174.). However, it has been reported that these polyphenolic compounds, in small concentrations, can be efficient anti-inflammatory, astringent, fungicidal, vasoconstrictive, and antioxidants (Xu et al. 2017Xu, Y., Liu, P., Xu, S., Koroleva, M., Zhang, S., Si, S. & Jin, Z. G. 2017. "Tannic acid as a plant-derived polyphenol exerts vasoprotection via enhancing KLF2 expression in endothelial cells". Scientific Reports, 7(1): 1-9, ISSN: 2045-2322, DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-017-06803-x. ). In this sense, Huang et al. (2018)Huang, Q., Liu, X., Zhao, G., Hu, T. & Wang, Y. 2018. "Potential and challenges of tannins as an alternative to in-feed antibiotics for farm animal production". Animal Nutrition, 4(2): 137-150, ISSN: 2405-6545, DOI: https://doi.org/10.1016/j.aninu.2017.09.004. reported that tannins can inhibit the growth of enterobacteriaceae and decrease the circulating cholesterol, when reducing the absorption of this lipid and expelling it through the feces.

In turn, the presence of flavonoids in the hydroalcoholic extract of the plant under study corroborates what was stated by Vargas et al. (2006)Vargas, D., Soto, M., González, V.A., Engleman, E.M. & Martínez, Á. 2006. "Cinética de acumulación y distribución de flavonoides en guayaba (Psidium guajava L.) ". Agrociencia, 40(1): 109-115, ISSN: 1405-3195., who detected that guava leaves are important sources of flavonoids. The extracts and leaves of guava (Psidium guajava) have a group of new components, only present in these plants, as is the case of gammapyrones, which belong to the of glycosylated flavonoids subclass. Afzal et al. (2019)Afzal, M., Iqbal, R., Mahmood, Z., Zeshan, B. & Wattoo, J.I. 2019. "Study of GC-MS and HPLC characterized metabolic compounds in guava (Psidium guajava L.) leaves". Pakistan Journal of Agricultural Sciences, 56(3): 709-713, ISSN: 0552-9034, DOI: https://doi.org/10.1016/j.btre.2020.e00536. found that extracts from P. guajava leaves regulate the functioning of the enteric nervous system in the digestive system, showing its antidiarrheal function.

Jiménez-Escrig et al. (2001)Jiménez-Escrig, A., Rincón, M., Pulido, R. & Saura-Calixto, F. 2001. "Guava fruit (Psidium guajava L.) as a new source of antioxidant dietary fiber". Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(11): 5489-5493, ISSN: 0021-8561, DOI: https://doi.org/10.1021/jf010147p. reported that the leaves and the juice of the P. guajava fruit reduced the activity of the free radicals DPPH (2.2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl) in in vitro tests and the oxidation of low-density lipoproteins induced by the copper.

Other authors suggest that these compounds (flavonoids) have phytostogenic activity, since they are structurally similar to natural estrogens (17 beta estradiol) as well as synthetic ones (Yang et al. 2000Yang, K., Lamprecht, S.A. & Liu, Y. 2000. "Chemoprevention studies of the flavonoids quercetin and rutin in normal and azoxymethane-treated mouse colon". Carcinogenesis, 21(9): 1655-1660, ISSN: 1460-2180, DOI: https://doi.org/10.1093/carcin/21.9.1655.). Ismail et al. (2012)Ismail, M., Minhas, P.S., Khanum, F., Sahana, V.M. & Sowmya, C. 2012. "Antibacterial activity of leaves extract of Guava (Psidium Guajava) ". International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 3(1): 1-2, ISSN: 2229-3701. had reported a decrease in the growth of Staphylococcus aureus and Escherichia coli, when using guava leaves with high flavonoid content in their diets.

The presence of anthocyanidins in the Psidium guajava powder is related to the decrease in oxidative stress and the stimulation of the immune system, due to the proliferation of lymphocytes and the secretion of cytokinins (interleukin II) by the activated lymphocytes (Wu et al. 2018Wu, H.Y., Yang, K.M. & Chiang, P.Y. 2018. "Roselle anthocyanins: Antioxidant properties and stability to heat and pH". Molecules, 23(6): 1357, ISSN: 1420-3049, DOI: https://doi.org/10.3390/molecules23061357.). Shipp and Abdel-Aal (2010)Shipp, J. & Abdel-Aal, E.S.M. 2010. "Food applications and physiological effects of anthocyanins as functional food ingredients". The Open Food Science Journal, 4(1): 7-22, ISSN: 1874-2564, DOI: https://doi.org/10.2174/1874256401004010007. reported that anthocyanidins are natural water-soluble pigments, which can increase the color of the egg yolk as an added value to the product. According to these results, the beneficial secondary metabolites in Psidium guajava leaves could benefit the biological response in birds.

Although other secondary metabolites (saponins, reducing sugars, quinones, triterpenes and steroids), responsible for the biological activity, were identified by phytochemical screening, the results are not conclusive to relate them to a possible effect on the production and quality of the egg of lying hens. Table 2 shows that different additions of P. guajava leaf powder did not statistically change (P> 0.05) the viability, food intake, unfit eggs and the initial and final weight of laying hens. However, the addition of 0.5 % of this medicinal plant increased the laying intensity by 3.28% and the egg weight by 1.67 g; in addition to reducing the mass conversion by 0.14 kg / kg in relation to the control treatment and the other treatments with P. guajava leaf powder (P <0.05).

The viability (100%) showed the safety of the Psidum guajava leaf powder used up to 1.5 % in the diets of laying hens during 10 experimental weeks, without causing morbidity and mortality (table 2). Apparently, P. guajava leaf powder, added in small concentrations (up to 1.5 %) in the diet of laying hens, did not cause adverse effects, since the metabolites did not modify the viability, live weight and food intake.

It has been recognized that a high supplementation with phytochemicals can decrease the assimilation of nutrients, cause diarrhea and weight loss (Huang et al. 2018Huang, Q., Liu, X., Zhao, G., Hu, T. & Wang, Y. 2018. "Potential and challenges of tannins as an alternative to in-feed antibiotics for farm animal production". Animal Nutrition, 4(2): 137-150, ISSN: 2405-6545, DOI: https://doi.org/10.1016/j.aninu.2017.09.004.). Ni et al. (2016)Ni, H., Martínez, Y. , Guan, G., Rodríguez, R., Más, D. & Liu, G. 2016. "Analysis of the impact of isoquinoline alkaloids, derived from Macleaya cordata extract, on the development and innate immune reaction in swine and poultry". BioMed Research International, 2016, Article ID: 1352146, 1-7, ISSN: 2314-6133, DOI: https://doi.org/10.1155/2016/1352146. reported that excessive intake of certain secondary metabolites can cause symptoms related to anti-nutritional factors in laying hens (lower food intake, low egg production and mortality).

The increase in the laying intensity, with the addition of 0.5 % of P. guajava powder, showed the effectiveness of this medicinal plant as a promoter of egg production in laying hens. Ghasemi et al. (2010)Ghasemi, R., Zarei, M. & Torki, M. 2010. "Adding medicinal herbs including garlic (Allium sativum) and thyme (Thymus vulgaris) to diet of laying hens and evaluating productive performance and egg quality characteristics". American Journal of Animal and Veterinary Science, 5(2): 1151-154, ISSN: 1557-4555. reported similar responses when adding garlic (Allium sativum) and thyme (Thymus vulgaris) powders in the diets of laying hens, confirming the beneficial effect of natural products, such as P. guajava powder. The possible phytoestrogenic effects of the polyphenolic compounds detected in P. guajava powder (table 2) could also influence on the improvement of egg production and mass conversion (Purdom et al. 1994Purdom, C.E., Hardiman, P.A., Bye, V.V.J., Eno, N.C., Tyler, C.R. & Sumpter, J.P. 1994. "Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works". Chemistry and Ecology, 8(4): 275-285, ISSN: 0275-7540, DOI: https://doi.org/10.1080/02757549408038554. and Ghasemi et al. 2010Ghasemi, R., Zarei, M. & Torki, M. 2010. "Adding medicinal herbs including garlic (Allium sativum) and thyme (Thymus vulgaris) to diet of laying hens and evaluating productive performance and egg quality characteristics". American Journal of Animal and Veterinary Science, 5(2): 1151-154, ISSN: 1557-4555. ). Çiftci et al. (2012)Çiftci, H.B. 2012. "Effect of estradiol­17β on follicle stimulating hormone secretion and egg laying performance of Japanese quail". Animal, 6(12): 1955, ISSN: 1751-7311, DOI: https://doi.org/10.1017/S1751731112000997. found that a higher circulation of estrogens in blood improves egg production in laying hens. Regarding the secondary metabolites and their beneficial functions in P. guajava leaf powder, their direct effect on the productivity of laying hens can be affirmed, since they cannot synthesize them.

The higher egg weight (T1) with this medicinal plant could be associated with the ideal intestinal conditions of birds, which favor the increase and development of the beneficial flora, since the secondary metabolites present in the P. guajava leaves can decrease the pathogenic bacteria (Más et al. 2015Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Betancur, C. & Rosabal, O. 2015. "Effect of dietary supplementation with Morinda citrifolia on productivity and egg quality of laying hens". Ciencia y Agricultura, 12(2): 7-12, ISSN: 0122-8420, DOI: https://doi.org/10.19053/01228420.4348.) and contribute to the competitive exclusion of the gastrointestinal tract (GIT). This effect in the intestine favors the absorption of Ca in the diets and its incorporation in the shell formation (Sahin et al. 2018Sahin, K., Orhan, C., Tuzcu, M., Hayirli, A., Komorowski, J.R. & Sahin, N. 2018. "Effects of dietary supplementation of arginine-silicate-inositol complex on absorption and metabolism of calcium of laying hens". PloS One, 13(1): e0189329, ISSN: 7885-2003, DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189329.). Apparently, the tannins in the medicinal powder did not affect the absorption of sulfur amino acids, since these amino acids are the main promoters of egg weight. It should highlighted that the higher addition (T2 and T3) of this natural product (P. guajava) decreased the productive response of laying hens compared to T0, perhaps due to the fact that the secondary metabolites exerted some antinutritional effects, without apparent affections in animals.

The eggs fit for intake were not affected by the supplementation of the natural product. Rosabal et al. (2017)Rosabal, O., Martínez, Y. , Rodríguez, R., Pupo, G., Olmo, C. & Más, D. 2017. "Efecto fitobiótico del polvo de hojas de Anacardium occidentale L. en las dietas de gallinas ponedoras". Revista Cubana de Plantas Medicinales , 22(1):30-35, ISSN: 1028-4796. and Salazar et al. (2017)Salazar, I., Martínez, Y. , Rodríguez, R. , Olmo, C., Aroche, R., Pupo, G., Rosabal, O. & Más, D. 2017. "Efecto de la suplementación dietética con polvo mixto de plantas medicinales en la productividad y calidad del huevo de gallinas ponedoras". Revista de Producción Animal, 29(3): 1-5, ISSN: 2224-7920. reported similar results, when using small proportions of medicinal plants in the diets of laying hens. These data are important, if it is takes into account that larger eggs are more prone to shell break (Taylor et al. 2016Taylor, D., Walsh, M., Cullen, A. & O’Reilly, P. 2016. "The fracture toughness of eggshell". Acta Biomaterialia, 37: 21-27, ISSN: 1742-7061, DOI: https://doi.org/10.1016/j.actbio.2016.04.028.), which shows that the additive increases the egg weight, without affecting its commercialization, since according to Jones et al. (2018)Jones, D.R., Ward, G.E., Regmi, P. & Karcher, D.M. 2018. "Impact of egg handling and conditions during extended storage on egg quality". Poultry Science, 97(2): 716-723, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.3382/ps/pex351. this indicator influences on the profitability of poultry activity.

Table 3 shows the effect of P. guajava powder on the external and internal quality of the eggs of laying hen. It was showed that the addition of P. guajava leaves did not modify the shape index, yolk height, shell surface, egg weight and Haugh unit, at 37 weeks of age. However, the shell thickness and the yolk color increased (P <0.05) with the addition of 0.5 % with respect to the other experimental treatments. In addition, in T3 the height of the dense white decreased (P <0.05) in relation to the control, without differences with the T1 and T2.

The highest thickness of the shell with T1 could be due that better intestinal health increased Ca absorption in the intestinal lumen, since according to Savón et al. (2007)Savón, L., Scull, I. & Martínez, M. 2007. "Integral foliage meals of three tropical legumes for poultry feeding. Chemical composition, physical properties and phytochemical screening". Cuban Journal of Agricultural Science, 41(1): 359-341, ISSN: 2079-3480. ideal pH conditions are needed by the insolubility or instability of this mineral. In addition, the possible phytoestrogenic action of the secondary metabolites could increase the incorporation of calcium into the shell. According to Elaroussi et al. (1994)Elaroussi, A., Forte, R., Eber, L. & Biellier, V. 1994. "Calcium homeostasis in the laying hen.: 1. Age and dietary calcium effects". Poultry Science, 73(10): 1581-1589, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.3382/ps.0731581., estrogens are the main transporters of calcium carbonate from the intestine to the bones and, in turn, enter to the homeostatic cycle of Ca. This can avoid the problems in the imbalance of this mineral in the bones, the incidence of problems in the legs and the shell thickness. However, further studies are necessary to validate this hypothesis. The T2 and T3 had results equivalent to the control, with worse results with respect to T1. According to Martínez et al. (2013)Martínez, Y., Martínez, O., Liu, G., Ren, W., Rodríguez, R., Fonseca, Y., Olmo, C., Isert, M., Aroche, R., Valdivié, M. & Nyachoti, C.M. 2013. "Effect of dietary supplementation with Anacardium occidentale on growth performance and immune and visceral organ weights in replacement laying pullets". Journal of Food, Agriculture and Environment, 13(3&4): 1352-1357, ISSN: 1459-0255. DOI: https://doi.org/10.1234/4.2013.4855 ., the beneficial effect of medicinal plants will depend on the chemical structure of the secondary metabolites, their concentration and level of addition in the bird diets.

Despite the beneficial effect of secondary metabolites of P. guajava leaves on the diets of laying hens, they did not improve the height of the dense white. On the contrary, this portion of the egg gradually decreased with the addition of P. guajava (table 3). Apparently, the intake of 1.65 g/bird/d of P. guajava (1.5 %) caused lower amino acid efficiency for the formation of this structure, since according to Keener et al. (2006)Keener, K.M., McAvoy, K.C., Foegeding, J.B., Curtis, A., Anderson, K.E. &. Osborne, J.A. 2006. "Effect of testing temperature on internal egg quality measure meets". Poultry Science, 85(10): 550-555, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.1093/ps/85.3.550. the amount of white depends on the balance in amino acids which provided by the diet protein. A deficiency in lysine or methionine reduces the weight of the albumen and decreases the concentration of all free amino acids. In addition, Rodríguez et al. (2011)Rodríguez, R., Cisneros, M., Valdivié, M. González, R. & Martínez, Y. 2011. "Efecto de una dieta con la inclusión de harina de caña proteica sobre la calidad de los huevos de gallinas ponedoras White Leghorn L33". Revista de Producción Animal, 23(1): 34-38, ISSN: 2224-7920. reported that albumin is characterized by its homogeneity, given by the liquid and thick white. The proportion of this structure varies depending on many factors, particularly the age of the egg.

Although the height of the dense white showed statistical differences, this did not influence on the Haugh units, which did not vary with the addition of the medicinal plant. Similar results found Rosabal et al. (2017)Rosabal, O., Martínez, Y. , Rodríguez, R., Pupo, G., Olmo, C. & Más, D. 2017. "Efecto fitobiótico del polvo de hojas de Anacardium occidentale L. en las dietas de gallinas ponedoras". Revista Cubana de Plantas Medicinales , 22(1):30-35, ISSN: 1028-4796. and Salazar et al. (2017)Salazar, I., Martínez, Y. , Rodríguez, R. , Olmo, C., Aroche, R., Pupo, G., Rosabal, O. & Más, D. 2017. "Efecto de la suplementación dietética con polvo mixto de plantas medicinales en la productividad y calidad del huevo de gallinas ponedoras". Revista de Producción Animal, 29(3): 1-5, ISSN: 2224-7920.. However, they did not agree with Martínez et al. (2012b)Martínez, Y., Escalona, A., Martínez, O., Olmo, C., Rodríguez, R., Iser, M., Betancur, C., Valdivié, M. & Liu, G. 2012b. "The use of Anacardium occidentale as nutraceutical in hypoprotein diets for laying hens". Cuban Journal of Agricultural Science, 46(4): 395-401, ISSN: 2079-3480., who found an increase in this indicator when using up to 1.5 % of Anacardium occidentale leaf powder. Nematinia et al. (2018)Nematinia, E. & Mehdizadeh, S.A. 2018. "Assessment of egg freshness by prediction of Haugh unit and albumen pH using an artificial neural network". Journal of Food Measurement and Characterization, 12(3): 1449-1459, ISSN: 2193-4134, DOI: https://doi.org/10.1007/s11694-018-9760-1. showed that the Haugh unit is at its maximum value, when the egg has just been laid or when it has cooled, which denotes a good degree of freshness.

The P. guajava leaf powder did not modify the yolk height, which corresponds to that reported by Martínez et al. (2012b)Martínez, Y., Escalona, A., Martínez, O., Olmo, C., Rodríguez, R., Iser, M., Betancur, C., Valdivié, M. & Liu, G. 2012b. "The use of Anacardium occidentale as nutraceutical in hypoprotein diets for laying hens". Cuban Journal of Agricultural Science, 46(4): 395-401, ISSN: 2079-3480., Más et al. (2015)Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Betancur, C. & Rosabal, O. 2015. "Effect of dietary supplementation with Morinda citrifolia on productivity and egg quality of laying hens". Ciencia y Agricultura, 12(2): 7-12, ISSN: 0122-8420, DOI: https://doi.org/10.19053/01228420.4348. and Salazar et al. (2017)Salazar, I., Martínez, Y. , Rodríguez, R. , Olmo, C., Aroche, R., Pupo, G., Rosabal, O. & Más, D. 2017. "Efecto de la suplementación dietética con polvo mixto de plantas medicinales en la productividad y calidad del huevo de gallinas ponedoras". Revista de Producción Animal, 29(3): 1-5, ISSN: 2224-7920., when they used various phytobiotics in the diets of laying hens. This structure of the egg is determined by the lipid content. Apparently, the secondary metabolites in the medicinal plant did not modify the metabolism of this biomolecule. In addition, other factors can determine this portion of the egg, such as egg weight, productive stage, age, and breed (Grobas et al. 2001Grobas, S., Méndez, J., Lázaro, R., Blas, C. & Mateos, G. 2001. "Influence of source and percentage of fat added to diet on performance and fatty acid composition of egg yolks of two strains of laying hens". Poultry Science, 80(8): 1171-1179, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.1093/ps/80.8.1171.).

The addition of phytobiotic additives in the diets of laying hens can determine the intensity of the yolk color, without affecting the performance of the birds, which is acceptable for the table egg industry, bakeries and other industries (Odunsi 2003Odunsi, A.A. 2003. "Assessment of lab (Lab pursuers) leaf meal as a feed ingredient and yolk colouring agent in the diet of layers". International Journal of Poultry Science, 2(1): 71-74, ISSN: 1682-8356, DOI: https://doi.org/10.3923/ijps.2003.71.74. ). However, it will depend on the concentration of the natural colorant in the plant material. In this study there was an increase in the yolk color with the addition of 0.5 % of P. guajava leaf powder, which could be due to the presence of anthocyanidins determined in the phytochemical screening (table 1). The natural colorant influences on the pigmentation of the yolk (Carrillo et al. 2005Carrillo, D., Carranco, M., Castillo., Castro, M., Ávila, E. & Pérez, G. 2005. "Cholesterol and n-3 and n-6 fatty acid content in eggs from laying hens fed with red crab meal (Pleuroncodes planipes)". Poultry Science, 84(1): 167-172, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.1093/ps/84.1.167.). However, the results show that the faster formation of the egg, with the addition of 0.5 % of P. guajava powder, could determine the highest deposition of pigments in the yolk, since in the treatments with 1 and 1.5 % there was a decrease of the yolk color (table 3).

The P. guajava leaf powder has a wide variety of secondary metabolites responsible for biological activity. The 0.5 % of P. guajava leaf powder is recommended in the diets of laying hens in their full laying peak to improve productivity and some indicators of egg quality.

Tamizaje fitoquímico de las hojas de Psidium guajava. Para la preparación de la muestra se tomaron hojas de 20 árboles de Psidium guajava, de la variedad enana roja cubana, con aproximadamente cinco años de edad, en la zona de Peralejo Bayamo-Granma, Cuba. Esta región se caracteriza por una topografía llana y suelo pardo con carbonato. Para la recolección se consideró la diversidad del tamaño, estructura y la clasificación óptima de las hojas, identificadas en el Departamento de Botánica, de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Granma.

Posterior a la recolección, se eliminaron las impurezas (principalmente polvo y tierra) de las hojas y se secaron al sol durante siete días. Luego, las hojas se molieron hasta obtener un polvo de 1 mm (Martínez et al. 2012aMartínez, Y., Martínez, O., Escalona, A. Soto, F. & Valdivié, M. 2012a. "Composición química y tamizaje fitoquímico del polvo de hojas y retoños del Anacardium occidentale L. (marañón) ". Revista Cubana de Plantas Medicinales, 17(1): 1-10, ISSN: 1028-4796.).

Extracciones sucesivas. Para lograr el mayor agotamiento de la muestra, se utilizó el esquema de extracción sucesiva con solventes de polaridad creciente: etanol y agua (Fajardo et al. 2018Fajardo, L., Viera, Y, Rosabal, U.M., Rodríguez, S., Guardia, Y. & Morales, G. 2018. "Tamizaje fitoquímico, control de la calidad y actividad antibacteriana del clon UF-650 en extractos de Theobroma cacao L. (cacao) ". Revista Cubana de Plantas Medicinales, 23(1): 1-12, ISSN: 1028-4796.). Se tomó el polvo seco, obtenido de las hojas de guayaba. Luego, se pesaron 5 g en una balanza analítica (BS 2202S SARTORIUS, China) y se adicionaron 50 mL de etanol al 70 % para la elaboración del extracto alcohólico y 50 mL de agua destilada para la obtención del extracto acuoso. Seguidamente, se realizó la extracción de forma análoga (Más et al. 2017Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, B., Pupo, G., Rosabal, O. & Olmo, G. 2017. "Análisis preliminar de los metabolitos secundarios de polvos mixtos de hojas de plantas medicinales". Revista Cubana de Plantas Medicinales. 22(1): 1-9, ISSN: 1028-4796.).

Tamizaje fitoquímico. Los análisis fitoquímicos se realizaron en el extracto hidroalcohólico, según el protocolo propuesto por Mijares et al. (2014)Mijares, M., Torres, E. & Hermosilla, R. 2014. "Tamizaje fitoquímico de los extractos de Faramea occidentalis (L.) A. Rich. (nabaco) ". Revista Cubana de Plantas Medicinales, 19(4): 421-432, ISSN: 1028-4796. y Rodríguez et al. (2018). Se hicieron los ensayos de resinas, Liebermann-Burchard (triterpenos y/o esteroides), espuma (saponinas), de ninhidrina (aminoácidos libres), Dragendorff y Mayer (alcaloides), Baljet (coumarinas), Fehling (carbohidratos reductores), cloruro férrico (fenoles o taninos), Borntrager (quinonas), Shinoda (flavonoides) y antocianidinas. La caracterización fitoquímica se realizó en el Centro de Estudio de Química Aplicada (CEQA), de la Facultad de Ciencias Técnicas, perteneciente a la Universidad de Granma, Cuba.

Ubicación experimental. El experimento in vivo se realizó en la granja avícola Antonio Maceo, en Bayamo, Granma, Cuba. La humedad relativa media fue de 78 %, la temperatura mínima promedio de 26.3 °C y la máxima promedio de 30.6°C.

Dietas, animales y tratamientos. Un total de 160 gallinas White Leghorn L-33, de 27 semanas de edad, se distribuyeron aleatoriamente en cuatro tratamientos y 10 repeticiones por tratamiento durante 70 d. Los tratamientos consistieron en una dieta control (T0) y la adición de 0.5 (T1), 1.0 (T2) y 1.5 % (T3) del polvo de hojas de Psidium guajava. Se consideraron los resultados de Más et al. (2016)Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Salazar, I., Aroche, R., López, B. & Marcella, D. 2016. "Efecto de la suplementación dietética de polvos de hojas de Psidium guajava y Anacardium occidentale en el comportamiento productivo e incidencia de diarrea de cerdos en pre y post-destete". Revista Computadorizada de Producción Porcina, 23(10): 106-113, ISSN: 1026-9053. y Aroche et al. (2018)Aroche, R., Martínez, Y., Ruan, Z., Guan, G., Waititu, S., Nyachoti, C.M., Más, D. & Shile L. 2018. "Dietary inclusion of a mixed powder of medicinal plant leaves enhances the feed efficiency and immune function in broiler chickens". Journal of Chemistry, 2018, ISSN: 2090-9063, DOI: https://doi.org/10.1155/2018/4073068. para seleccionar los niveles de adición del polvo de hojas de P. guajava. Además, se utilizó la misma dieta control para gallinas ponedoras, aplicada en un experimento anterior (Rosabal et al. 2017Rosabal, O., Martínez, Y. , Rodríguez, R., Pupo, G., Olmo, C. & Más, D. 2017. "Efecto fitobiótico del polvo de hojas de Anacardium occidentale L. en las dietas de gallinas ponedoras". Revista Cubana de Plantas Medicinales , 22(1):30-35, ISSN: 1028-4796.), formulado a partir de maíz y torta de soya, según lo recomendado por la UECAN (2007)UECAN (Unión de Empresas del Centro Avícola Nacional). 2007. Aportes de los piensos avícolas. Ed. Ministerio de la Agricultura. La Habana, Cuba..

Condiciones experimentales. La unidad experimental consistió en una jaula metálica de 40 x 40 cm, donde se alojaron cuatro gallinas. Las aves recibieron 110 g de alimento/gallina/d. El agua se suministró ad libitum mediante un niple/jaula y se ofertaron 16 horas de iluminación cada día. El experimento tuvo un período de adaptación de 15 días (Martínez et al. 2012bMartínez, Y., Escalona, A., Martínez, O., Olmo, C., Rodríguez, R., Iser, M., Betancur, C., Valdivié, M. & Liu, G. 2012b. "The use of Anacardium occidentale as nutraceutical in hypoprotein diets for laying hens". Cuban Journal of Agricultural Science, 46(4): 395-401, ISSN: 2079-3480.). A las aves en experimentación no se les suministró medicamento ni atención veterinaria terapéutica durante la etapa experimental.

Indicadores productivos. Los pesos inicial y final de las gallinas ponedoras se realizaron de forma individual a las 27 y 37 semanas de edad en una balanza digital SARTORIUS, modelo BL 1500, con precisión ± 0.10 g. El peso del huevo se realizó semanalmente: 20 huevos/tratamiento, entre las 8:30 y 9:30 a.m. y se calculó el peso promedio.

Para determinar la intensidad de puesta se consideró la producción total de huevos/semana/tratamiento y se asumió como 100 % un huevo/d/ave alojada. La conversión masal se calculó al considerar el alimento consumido, el peso del huevo por repetición y el número de huevos puestos. También se computó la viabilidad al finalizar el experimento. El porcentaje de los huevos no aptos (cascados, fárfara y roto) se calculó por la fórmula: % Huevos no aptos (HNA), % HNA= $\frac{\mathrm{H}\mathrm{N}\mathrm{A}\mathrm{*}100}{\mathrm{h}\mathrm{u}\mathrm{e}\mathrm{v}\mathrm{o}\mathrm{s}\mathrm{}\mathrm{a}\mathrm{p}\mathrm{t}\mathrm{o}\mathrm{s}}$

Calidad externa e interna del huevo. En la semana 37 se muestrearon 20 huevos/tratamiento para determinar los indicadores de calidad externa e interna del huevo. El peso del huevo se determinó con una balanza digital OHAUS® (China), con precisión de 0.01 g. Para calcular el índice de forma (IF) se utilizó la fórmula: $IF=\frac{Diámetromenor}{Diámetromayor}100.$ Para medir el grosor de la cáscara en el ecuador y los polos superior e inferior del huevo se utilizó un pie de rey de fabricación rusa, con precisión de ± 0.01 mm. La superficie de la cáscara se determinó por la fórmula de Carter (1975)Carter T.C. 1975. "The hen´s egg: Estimation of shell superficial area and egg volume using measurement of fresh egg weight and breadth alone or in combination". British Poultry Science, 16: 541-543, ISSN: 1466-1799, DOI: https://doi.org/10.1080/00071667508416224., donde Área= $3.9782*peso del huev{o}^{0.7056}.$

La altura de la clara densa y de la yema se midió con un calibrador de altura, con exactitud de ± 0.01 mm. El color de la yema se determinó por el abanico de Roche, de 15 colores. Los registros de las unidades Haugh (UH) se calcularon por la relación entre el peso del huevo (W) y la altura de la clara densa (H) mediante la fórmula: $UH=100*\text{log}\left(h-1.7W^{0.37}+7.6\right)$ (Rosabal et al. 2017Rosabal, O., Martínez, Y. , Rodríguez, R., Pupo, G., Olmo, C. & Más, D. 2017. "Efecto fitobiótico del polvo de hojas de Anacardium occidentale L. en las dietas de gallinas ponedoras". Revista Cubana de Plantas Medicinales , 22(1):30-35, ISSN: 1028-4796.).

Análisis estadístico. Los datos se procesaron mediante análisis de varianza (Anova), de clasificación simple, en un diseño totalmente aleatorizado. En los casos necesarios, se empleó la dócima de Duncan (1955)Duncan, B. 1955. "Multiple ranges and multiple F test". Biometrics, 11(3): 1-42, ISSN: 1541-0420, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478. para determinar las diferencias múltiples entre medias, según el programa estadístico SPSS versión 23.0. El por ciento de huevos no aptos se analizó por comparación de proporciones mediante el programa COMPARPRO 1.0 (Font et al. 2007Font, H., Noda, A., Torres, V., Herrera, M., Lizazo, D., Sarduy, L. & Rodríguez, L. 2007. COMPARPRO: Comparación de Proporciones, Versión: 1.0. Departamento de Biomatemática, Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.).

Los resultados del tamizaje fitoquímico de los extractos de hojas de Psidium guajava (tabla 1) muestran la diversidad de metabolitos secundarios en el extracto hidroalcohólico (principalmente flavonoides), metabolitos responsables de diferentes actividades biológicas cuando se utilizan en pequeñas concentraciones en las dietas (Salazar et al. 2019Salazar, I., Rodríguez, R. , Betancur, C., Martínez, Y. & Guillaume, J. 2019. "Análisis de los metabolitos secundarios del polvo de hojas de Origanum vulgare y Ficus pandurata". Revista de Producción Animal, 31(2): 1-3, ISSN: 2224-7920. y Martínez et al. 2020Martínez, Y., Más, D., Betancur, C., Gebeyew, K., Adebowale, T., Hussain, T., Lan, W. & Ding, X. 2020. "Role of the phytochemical compounds like modulators on gut microbiota and oxidative stress". Current Pharmaceutical Design, 26(22): 2642-2656, ISSN: 1381-6128, DOI: http://doi.org/10.2174/1381612826666200515132218.). Además, no se observaron alcaloides, coumarinas y resinas en el extracto hidroalcohólico de las hojas de P. guajava.

Los taninos presentes en las hojas de Psidium guajava han sido descritos por Más et al. (2015)Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Betancur, C. & Rosabal, O. 2015. "Effect of dietary supplementation with Morinda citrifolia on productivity and egg quality of laying hens". Ciencia y Agricultura, 12(2): 7-12, ISSN: 0122-8420, DOI: https://doi.org/10.19053/01228420.4348. y Mapatac (2017)Mapatac, L.C. 2017. "Potency of medicinal leaves in the growth performance of broiler chicks". Recoletos Multidisciplinary Research Journal, 3(1): 197-206, ISSN: 2244-6710, DOI: http://doi.org/10.32871/rmrj1503.01.16. como factores anti-nutricionales, cuando están en exceso en las dietas o fármacos, porque limitan la absorción de algunos nutrientes como el hierro y los aminoácidos (Sobral-Souza et al. 2019Sobral-Souza, C.E., Silva, A.R., Leite, N.F., Rocha, J.E., Sousa, A.K., Costa, J.G., Menendesm I.R.A., Cunha, F.A.B., Rolim, L.A. & Coutinho, H.D. 2019. "Psidium guajava bioactive product chemical analysis and heavy metal toxicity reduction". Chemosphere, 216(2): 785-793, ISSN: 0045-6535, DOI: https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2018.10.174.). No obstante, se ha informado que estos compuestos polifenólicos, en pequeñas concentraciones, pueden ser eficientes antinflamatorios, astringentes, fungicidas, vasoconstrictores y antioxidantes (Xu et al. 2017Xu, Y., Liu, P., Xu, S., Koroleva, M., Zhang, S., Si, S. & Jin, Z. G. 2017. "Tannic acid as a plant-derived polyphenol exerts vasoprotection via enhancing KLF2 expression in endothelial cells". Scientific Reports, 7(1): 1-9, ISSN: 2045-2322, DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-017-06803-x. ). En este sentido, Huang et al. (2018)Huang, Q., Liu, X., Zhao, G., Hu, T. & Wang, Y. 2018. "Potential and challenges of tannins as an alternative to in-feed antibiotics for farm animal production". Animal Nutrition, 4(2): 137-150, ISSN: 2405-6545, DOI: https://doi.org/10.1016/j.aninu.2017.09.004. informaron que los taninos pueden inhibir el crecimiento de enterobacterias y disminuir el colesterol circulante, al reducir la absorción de este lípido y expulsarlo a través de las heces.

A su vez, la presencia de flavonoides en el extracto hidroalcohólico de la planta en estudio corrobora lo expuesto por Vargas et al. (2006)Vargas, D., Soto, M., González, V.A., Engleman, E.M. & Martínez, Á. 2006. "Cinética de acumulación y distribución de flavonoides en guayaba (Psidium guajava L.) ". Agrociencia, 40(1): 109-115, ISSN: 1405-3195., quienes detectaron que las hojas de guayaba son importantes fuentes de flavonoides. Los extractos y hojas de guayaba (Psidium guajava) poseen un grupo de nuevos componentes, solo presentes en estas plantas, como es el caso de las gammapironas, que pertenecen a la subclase de flavonoides glicosilatos. Afzal et al. (2019)Afzal, M., Iqbal, R., Mahmood, Z., Zeshan, B. & Wattoo, J.I. 2019. "Study of GC-MS and HPLC characterized metabolic compounds in guava (Psidium guajava L.) leaves". Pakistan Journal of Agricultural Sciences, 56(3): 709-713, ISSN: 0552-9034, DOI: https://doi.org/10.1016/j.btre.2020.e00536. encontraron que los extractos de las hojas de P. guajava regulan el funcionamiento del sistema nervioso entérico en el sistema digestivo, lo que demuestra su función antidiarreica.

Jiménez-Escrig et al. (2001)Jiménez-Escrig, A., Rincón, M., Pulido, R. & Saura-Calixto, F. 2001. "Guava fruit (Psidium guajava L.) as a new source of antioxidant dietary fiber". Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(11): 5489-5493, ISSN: 0021-8561, DOI: https://doi.org/10.1021/jf010147p. informaron que las hojas y el jugo de la fruta P. guajava redujeron la actividad de los radicales libres DPPH (2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo) en pruebas in vitro y la oxidación de lipoproteínas de baja densidad inducida por el cobre. Otros autores plantean que estos compuestos (flavonoides) tienen actividad fitoestogénica, ya que estructuralmente son similares a los estrógenos naturales (17 beta estradiol) como sintéticos (Yang et al. 2000Yang, K., Lamprecht, S.A. & Liu, Y. 2000. "Chemoprevention studies of the flavonoids quercetin and rutin in normal and azoxymethane-treated mouse colon". Carcinogenesis, 21(9): 1655-1660, ISSN: 1460-2180, DOI: https://doi.org/10.1093/carcin/21.9.1655.). Ismail et al. (2012)Ismail, M., Minhas, P.S., Khanum, F., Sahana, V.M. & Sowmya, C. 2012. "Antibacterial activity of leaves extract of Guava (Psidium Guajava) ". International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 3(1): 1-2, ISSN: 2229-3701. habían señalado disminución del crecimiento de Staphylococcus aureus y Escherichia coli, al utilizar las hojas de guayaba con altos contenidos de flavonoides en las dietas.

La presencia de antocianidinas en el polvo de Psidium guajava se relaciona con la disminución del estrés oxidativo y la estimulación del sistema inmune, debido a la proliferación de linfocitos y la secreción de citocininas (interleucina II) por los linfocitos activados (Wu et al. 2018Wu, H.Y., Yang, K.M. & Chiang, P.Y. 2018. "Roselle anthocyanins: Antioxidant properties and stability to heat and pH". Molecules, 23(6): 1357, ISSN: 1420-3049, DOI: https://doi.org/10.3390/molecules23061357.). Shipp y Abdel-Aal (2010)Shipp, J. & Abdel-Aal, E.S.M. 2010. "Food applications and physiological effects of anthocyanins as functional food ingredients". The Open Food Science Journal, 4(1): 7-22, ISSN: 1874-2564, DOI: https://doi.org/10.2174/1874256401004010007. informaron que las antocianidinas son pigmentos hidrosolubles naturales, que pueden incrementar la coloración de la yema del huevo como un valor agregado al producto. De acuerdo con estos resultados, los metabolitos secundarios benéficos en las hojas de Psidium guajava podrían beneficiar la respuesta biológica en las aves.

A pesar de que se identificaron por tamizaje fitoquímico otros metabolitos secundarios (saponinas, azúcares reductores, quinonas, triterpenos y esteroides), responsables de la actividad biológica, los resultados no son concluyentes para relacionarlos con un posible efecto en la producción y calidad del huevo de gallinas ponedoras.

La tabla 2 muestra que diferentes adiciones de polvo de hojas de P. guajava no cambiaron estadísticamente (P>0.05) la viabilidad, el consumo de alimento, los huevos no aptos y el peso inicial y final de las gallinas ponedoras. Sin embargo, la adición de 0.5 % de esta planta medicinal incrementó la intensidad de puesta en 3.28 % y el peso del huevo en 1.67 g; además de disminuir la conversión masal en 0.14 kg/kg en relación con elal tratamiento control y los otros tratamientos con polvo de hojas de P. guajava (P<0.05).

La viabilidad (100 %) mostró la inocuidad del polvo de hojas de Psidum guajava utilizado hasta 1.5% en las dietas de gallinas ponedoras durante 10 semanas experimentales, sin provocar morbimortalidad (tabla 2). Al parecer, el polvo de hojas de P. guajava, adicionado en pequeñas concentraciones (hasta 1.5 %) en la dieta de gallinas ponedoras, no provocó efectos adversos, ya que los metabolitos presentes no modificaron la viabilidad, el peso vivo y el consumo de alimento.

Se ha reconocido que una alta suplementación con fitoquímicos puede disminuir la asimilación de los nutrientes, provocar diarreas y pérdidas de peso (Huang et al. 2018Huang, Q., Liu, X., Zhao, G., Hu, T. & Wang, Y. 2018. "Potential and challenges of tannins as an alternative to in-feed antibiotics for farm animal production". Animal Nutrition, 4(2): 137-150, ISSN: 2405-6545, DOI: https://doi.org/10.1016/j.aninu.2017.09.004.). Ni et al. (2016)Ni, H., Martínez, Y. , Guan, G., Rodríguez, R., Más, D. & Liu, G. 2016. "Analysis of the impact of isoquinoline alkaloids, derived from Macleaya cordata extract, on the development and innate immune reaction in swine and poultry". BioMed Research International, 2016, Article ID: 1352146, 1-7, ISSN: 2314-6133, DOI: https://doi.org/10.1155/2016/1352146. informaron que un consumo excesivo de ciertos metabolitos secundarios puede ocasionar síntomas relacionados con factores anti-nutricionales en las gallinas ponedoras (menor consumo de alimento, baja producción del huevo y mortalidad).

El incremento en la intensidad de puesta, con la adición de 0.5 % de polvo de P. guajava, demostró la efectividad de esta planta medicinal como promotora de la producción de huevos en gallinas ponedoras. Ghasemi et al. (2010)Ghasemi, R., Zarei, M. & Torki, M. 2010. "Adding medicinal herbs including garlic (Allium sativum) and thyme (Thymus vulgaris) to diet of laying hens and evaluating productive performance and egg quality characteristics". American Journal of Animal and Veterinary Science, 5(2): 1151-154, ISSN: 1557-4555. informaron respuestas similares al adicionar polvos de ajo (Allium sativum) y tomillo (Thymus vulgaris) en las dietas de gallinas ponedoras, lo que confirma el efecto benéfico de los productos naturales, como el polvo de P. guajava. Los posibles efectos fitoestrogénicos de los compuestos polifenólicos detectados en el polvo de P. guajava (tabla 2) también podrían influir en el mejoramiento de la producción de huevos y en la conversión masal (Purdom et al. 1994Purdom, C.E., Hardiman, P.A., Bye, V.V.J., Eno, N.C., Tyler, C.R. & Sumpter, J.P. 1994. "Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works". Chemistry and Ecology, 8(4): 275-285, ISSN: 0275-7540, DOI: https://doi.org/10.1080/02757549408038554. y Ghasemi et al. 2010Ghasemi, R., Zarei, M. & Torki, M. 2010. "Adding medicinal herbs including garlic (Allium sativum) and thyme (Thymus vulgaris) to diet of laying hens and evaluating productive performance and egg quality characteristics". American Journal of Animal and Veterinary Science, 5(2): 1151-154, ISSN: 1557-4555. ). Çiftci et al. (2012)Çiftci, H.B. 2012. "Effect of estradiol­17β on follicle stimulating hormone secretion and egg laying performance of Japanese quail". Animal, 6(12): 1955, ISSN: 1751-7311, DOI: https://doi.org/10.1017/S1751731112000997. encontraron que una mayor circulación de los estrógenos en sangre mejora la producción de huevo en gallinas ponedoras. En cuanto a los metabolitos secundarios y sus funciones benéficas en el polvo de hojas de P. guajava, se puede afirmar su efecto directo en la productividad de las gallinas ponedoras, ya que estas no los pueden sintetizar.

El mayor peso del huevo (T1) con esta planta medicinal pudo estar asociado a las condiciones idóneas intestinales de las aves, que favorecen el incremento y desarrollo de la flora benéfica, ya que los metabolitos secundarios presentes en las hojas de P. guajava pueden disminuir las bacterias patógenas (Más et al. 2015Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Betancur, C. & Rosabal, O. 2015. "Effect of dietary supplementation with Morinda citrifolia on productivity and egg quality of laying hens". Ciencia y Agricultura, 12(2): 7-12, ISSN: 0122-8420, DOI: https://doi.org/10.19053/01228420.4348.) y contribuir a la exclusión competitiva del tracto gastrointestinal (TGI). Este efecto en el intestino favorece la absorción del Ca presente en las dietas y su incorporación en la formación de la cáscara (Sahin et al. 2018Sahin, K., Orhan, C., Tuzcu, M., Hayirli, A., Komorowski, J.R. & Sahin, N. 2018. "Effects of dietary supplementation of arginine-silicate-inositol complex on absorption and metabolism of calcium of laying hens". PloS One, 13(1): e0189329, ISSN: 7885-2003, DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189329.). Al parecer, los taninos en el polvo medicinal no afectaron la absorción de los aminoácidos azufrados, ya que estos aminoácidos son los principales promotores del peso del huevo. Se debe desatacar que la mayor adición (T2 y T3) de este producto natural (P. guajava) disminuyó la respuesta productiva de las gallinas ponedoras en comparación con el T0, quizás debido a que los metabolitos secundarios ejercieron algunos efectos antinutricionales, sin afecciones aparentes en los animales.

Los huevos aptos para el consumo no se afectaron por la suplementación del producto natural. Rosabal et al. (2017)Rosabal, O., Martínez, Y. , Rodríguez, R., Pupo, G., Olmo, C. & Más, D. 2017. "Efecto fitobiótico del polvo de hojas de Anacardium occidentale L. en las dietas de gallinas ponedoras". Revista Cubana de Plantas Medicinales , 22(1):30-35, ISSN: 1028-4796. y Salazar et al. (2017)Salazar, I., Martínez, Y. , Rodríguez, R. , Olmo, C., Aroche, R., Pupo, G., Rosabal, O. & Más, D. 2017. "Efecto de la suplementación dietética con polvo mixto de plantas medicinales en la productividad y calidad del huevo de gallinas ponedoras". Revista de Producción Animal, 29(3): 1-5, ISSN: 2224-7920. informaron resultados similares, al utilizar pequeñas proporciones de plantas medicinales en las dietas de gallinas ponedoras. Estos datos son importantes, si se tiene en cuenta que huevos más grandes son más propensos a la rotura de la cáscara (Taylor et al. 2016Taylor, D., Walsh, M., Cullen, A. & O’Reilly, P. 2016. "The fracture toughness of eggshell". Acta Biomaterialia, 37: 21-27, ISSN: 1742-7061, DOI: https://doi.org/10.1016/j.actbio.2016.04.028.), lo que demuestra que el aditivo incrementa el peso del huevo, sin afectar su comercialización, ya que según Jones et al. (2018)Jones, D.R., Ward, G.E., Regmi, P. & Karcher, D.M. 2018. "Impact of egg handling and conditions during extended storage on egg quality". Poultry Science, 97(2): 716-723, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.3382/ps/pex351. este indicador influye en la rentabilidad de la actividad avícola.

La tabla 3 muestra el efecto del polvo de P. guajava en la calidad externa e interna de los huevos de gallinas ponedoras. Se evidenció que la adición de las hojas de P. guajava no modificó el índice de forma, altura de la yema, superficie de la cáscara, peso del huevo y unidad Haugh, a las 37 semanas de edad. Sin embargo, el grosor de la cáscara y el color de la yema se incrementaron (P<0.05) con la adición de 0.5 % con respecto a los otros tratamientos experimentales. Además, en T3 disminuyó (P<0.05) la altura de la clara densa con relación al control, sin diferencias con el T1 y T2.

El mayor grosor de la cáscara con el T1 se pudo deber a que una mejor salud intestinal incrementó la absorción del Ca en el lumen intestinal, ya que según Savón et al. (2007)Savón, L., Scull, I. & Martínez, M. 2007. "Integral foliage meals of three tropical legumes for poultry feeding. Chemical composition, physical properties and phytochemical screening". Cuban Journal of Agricultural Science, 41(1): 359-341, ISSN: 2079-3480. se necesitan condiciones idóneas de pH por la insolubilidad o inestabilidad de este mineral. Además, la posible acción fitoestrogénica de los metabolitos secundarios pudo incrementar la incorporación del calcio a la cáscara. Según Elaroussi et al. (1994)Elaroussi, A., Forte, R., Eber, L. & Biellier, V. 1994. "Calcium homeostasis in the laying hen.: 1. Age and dietary calcium effects". Poultry Science, 73(10): 1581-1589, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.3382/ps.0731581., los estrógenos son los principales transportadores del carbonato cálcico del intestino a los huesos y, a su vez, entran al ciclo homeostático del Ca. Esto puede evitar los problemas en el desbalance de ese mineral en los huesos, la incidencia de problemas en las patas y el grosor de la cáscara. Sin embargo, estudios posteriores son necesarios para validar esta hipótesis. Los T2 y T3 tuvieron resultados equivalentes al control, con peores resultados con respecto al T1. Según Martínez et al. (2013)Martínez, Y., Martínez, O., Liu, G., Ren, W., Rodríguez, R., Fonseca, Y., Olmo, C., Isert, M., Aroche, R., Valdivié, M. & Nyachoti, C.M. 2013. "Effect of dietary supplementation with Anacardium occidentale on growth performance and immune and visceral organ weights in replacement laying pullets". Journal of Food, Agriculture and Environment, 13(3&4): 1352-1357, ISSN: 1459-0255. DOI: https://doi.org/10.1234/4.2013.4855 ., el efecto benéfico de las plantas medicinales dependerá de la estructura química de los metabolitos secundarios, su concentración y nivel de adición en las dietas de las aves.

A pesar del efecto benéfico de los metabolitos secundarios de las hojas de P. guajava en las dietas de las gallinas ponedoras, estos no mejoraron la altura de la clara densa. Al contrario, esta porción del huevo disminuyó de forma paulatina con la adición de P. guajava (tabla 3). Al parecer, el consumo de 1.65 g/ave/d de P. guajava (1.5 %) provocó menor eficiencia aminoacídica para la formación de esta estructura, ya que según Keener et al. (2006)Keener, K.M., McAvoy, K.C., Foegeding, J.B., Curtis, A., Anderson, K.E. &. Osborne, J.A. 2006. "Effect of testing temperature on internal egg quality measure meets". Poultry Science, 85(10): 550-555, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.1093/ps/85.3.550. la cantidad de clara depende del equilibrio en los aminoácidos que aporta la proteína de la dieta. Una deficiencia en lisina o metionina reduce el peso del albumen y disminuye la concentración de todos los aminoácidos libres. Además, Rodríguez et al. (2011)Rodríguez, R., Cisneros, M., Valdivié, M. González, R. & Martínez, Y. 2011. "Efecto de una dieta con la inclusión de harina de caña proteica sobre la calidad de los huevos de gallinas ponedoras White Leghorn L33". Revista de Producción Animal, 23(1): 34-38, ISSN: 2224-7920. informaron que la albúmina se caracteriza por su homogeneidad, dada por la clara líquida y espesa. La proporción de esta estructura varía en función de muchos factores, en particular de la edad del huevo.

A pesar de que la altura de la clara densa mostró diferencias estadísticas, esto no influyó en las unidades Haugh, que no variaron con la adición de la planta medicinal. Resultados similares encontraron Rosabal et al. (2017)Rosabal, O., Martínez, Y. , Rodríguez, R., Pupo, G., Olmo, C. & Más, D. 2017. "Efecto fitobiótico del polvo de hojas de Anacardium occidentale L. en las dietas de gallinas ponedoras". Revista Cubana de Plantas Medicinales , 22(1):30-35, ISSN: 1028-4796. y Salazar et al. (2017)Salazar, I., Martínez, Y. , Rodríguez, R. , Olmo, C., Aroche, R., Pupo, G., Rosabal, O. & Más, D. 2017. "Efecto de la suplementación dietética con polvo mixto de plantas medicinales en la productividad y calidad del huevo de gallinas ponedoras". Revista de Producción Animal, 29(3): 1-5, ISSN: 2224-7920.. Sin embargo, no coincidieron con Martínez et al. (2012b)Martínez, Y., Escalona, A., Martínez, O., Olmo, C., Rodríguez, R., Iser, M., Betancur, C., Valdivié, M. & Liu, G. 2012b. "The use of Anacardium occidentale as nutraceutical in hypoprotein diets for laying hens". Cuban Journal of Agricultural Science, 46(4): 395-401, ISSN: 2079-3480., quienes encontraron aumento de este indicador al utilizar hasta 1.5 % del polvo de hojas de Anacardium occidentale. Nematinia et al. (2018)Nematinia, E. & Mehdizadeh, S.A. 2018. "Assessment of egg freshness by prediction of Haugh unit and albumen pH using an artificial neural network". Journal of Food Measurement and Characterization, 12(3): 1449-1459, ISSN: 2193-4134, DOI: https://doi.org/10.1007/s11694-018-9760-1. indicaron que la unidad Haugh se encuentra en su valor máximo, cuando el huevo acaba de ser puesto o cuando se haya enfriado, lo que denota buen grado de frescura.

El polvo de hojas de P. guajava no modificó la altura de la yema, lo que se corresponde con lo informado por Martínez et al. (2012b)Martínez, Y., Escalona, A., Martínez, O., Olmo, C., Rodríguez, R., Iser, M., Betancur, C., Valdivié, M. & Liu, G. 2012b. "The use of Anacardium occidentale as nutraceutical in hypoprotein diets for laying hens". Cuban Journal of Agricultural Science, 46(4): 395-401, ISSN: 2079-3480., Más et al. (2015)Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Betancur, C. & Rosabal, O. 2015. "Effect of dietary supplementation with Morinda citrifolia on productivity and egg quality of laying hens". Ciencia y Agricultura, 12(2): 7-12, ISSN: 0122-8420, DOI: https://doi.org/10.19053/01228420.4348. y Salazar et al. (2017)Salazar, I., Martínez, Y. , Rodríguez, R. , Olmo, C., Aroche, R., Pupo, G., Rosabal, O. & Más, D. 2017. "Efecto de la suplementación dietética con polvo mixto de plantas medicinales en la productividad y calidad del huevo de gallinas ponedoras". Revista de Producción Animal, 29(3): 1-5, ISSN: 2224-7920., cuando utilizaron varios fitobióticos en las dietas de gallinas ponedoras. Esta estructura del huevo está determinada por el contenido de lípidos. Al parecer, los metabolitos secundarios en la planta medicinal no modificaron el metabolismo de esta biomolécula. Además, otros factores pueden determinar esta porción del huevo, como el peso del huevo, la etapa productiva, la edad y raza (Grobas et al. 2001Grobas, S., Méndez, J., Lázaro, R., Blas, C. & Mateos, G. 2001. "Influence of source and percentage of fat added to diet on performance and fatty acid composition of egg yolks of two strains of laying hens". Poultry Science, 80(8): 1171-1179, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.1093/ps/80.8.1171.).

La adición de aditivos fitobióticos en las dietas de gallinas ponedoras puede determinar la intensidad del color de la yema, sin afectar el desempeño de las aves, lo que es aceptable para la industria de huevos de mesa, panaderías y otras industrias (Odunsi 2003Odunsi, A.A. 2003. "Assessment of lab (Lab pursuers) leaf meal as a feed ingredient and yolk colouring agent in the diet of layers". International Journal of Poultry Science, 2(1): 71-74, ISSN: 1682-8356, DOI: https://doi.org/10.3923/ijps.2003.71.74. ). No obstante, estará en dependencia de la concentración del colorante natural en el material vegetal. En este estudio hubo incremento del color de la yema con la adición de 0.5 % de polvo de hojas de P. guajava, lo que se pudo deber a la presencia de antocianidinas determinadas en el tamizaje fitoquímico (tabla 1). El colorante natural influye en la pigmentación de la yema (Carrillo et al. 2005Carrillo, D., Carranco, M., Castillo., Castro, M., Ávila, E. & Pérez, G. 2005. "Cholesterol and n-3 and n-6 fatty acid content in eggs from laying hens fed with red crab meal (Pleuroncodes planipes)". Poultry Science, 84(1): 167-172, ISSN: 0032-5791, DOI: https://doi.org/10.1093/ps/84.1.167.). No obstante, los resultados indican que la formación más rápida del huevo, con la adición de 0.5 % de polvo de P. guajava, pudo determinar la mayor deposición de pigmentos en la yema, ya que en los tratamientos con 1 y 1.5 % hubo disminución del color de la yema (tabla 3).

El polvo de hojas de P. guajava tiene amplia variedad de metabolitos secundarios responsables de actividad biológica. Se recomienda 0.5 % del polvo de hojas de P. guajava en las dietas de gallinas ponedoras en pleno pico de postura para mejorar la productividad y algunos indicadores de la calidad del huevo.