Solid-state fermentation (SSF) experiment was carried out under high tropic conditions (2,860 m.a.s.l.), in the biochemistry and animal nutrition laboratory of the Universidad Pedagógica y Tecnológica of Colombia (UPTC), located on Avenida Central del Norte, via Tunja-Paipa, in Tunja municipality, Boyacá department, Colombia. This region has a mean temperature of 15 °C and mean annual rainfall of 553 mm.

Experimental procedure. A yogurt was made with active strains of Lactobacillus delbrueckiis ssp bulgaricus and Streptococcus thermophilus (commercially freeze-dried, Liofast Y452B, SACCO ®), which was used as inoculum (2% v/v and concentration of 0.99 x 108 CFU/mL) for obtaining the microbial preparation, according to the methodology of Borras (2017)Borras, L.M. 2017. Obtención de un alimento por fermentación en estado sólido de residuos de poscosecha de Solanum tuberosum para la suplementación de rumiante. PhD Thesis. Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba, p.100.. This preparation (2%) was mixed at room temperature (15 ± 2 ºC) with urea (1%), mineral premix (0.50%), sodium sulfate (0.50%), calcium carbonate and potato post-harvest wastes, previously cleaned and chopped. The inclusion percentage of calcium carbonate (CaCO3) varied according to the experimental treatments (0, 0.25, 0.50 and 0.75%).

Table 1 shows the composition of mixtures prepared under the mentioned conditions (0h and 15 ºC). They were distributed in plastic bags, with 1 kg capacity. Each bag was considered an experimental unit, with three repetitions per treatment. They were divided into two groups and incubated at 20 and 25 °C respectively, in individual Memmert® incubators for 48 h. Samples were taken at 24 and 48 h of fermentation to determine chemical and microbiological indicators.

Contents of the bags of each treatment (three repetitions) were collected and homogenized. Then, 5 g of sample were taken and placed in a 100 mL Erlenmeyer flask. Later, 45 mL of sterile distilled water was added. The preparation was shaken for 30 min. on an Adams® electric shaker. Subsequently, the filtrate was obtained to measure pH, concentration of organic acids, ammonia, and also perform a microbiological analysis.

Solids were dried in an oven at 60 °C and ground in a UDY® hammer mill, with a 1 mm sieve, for chemical quantification analysis. Dry matter (DM) and crude protein (CP) were determined according to AOAC (2005)AOAC (Association of Official Analytical Chemists). 2005. Official Methods of Analysis 18th Ed. Ed. Association of Officiating Analytical Chemists. Washington D.C., U.S.A, ISBN: 978-093-5584-752., and for true protein (TP), Berstein, cited by Meir (1986)Meir, H. 1986. Laborproktibuire. Tierernährung Und, futtermittel für Tiere Produzenten. 45: 3. Verlag, Berlin, Germany., was followed.

pH was measured in an Okaton® automatic potentiometer and ammonia (NH3) was determined by the Berthelot technique (Martínez et al. 2003Martínez, F., Balciunas, E., Salgado, J., González, J., Converti, A. & Oliveira, R. 2003. "Lactic acid properties, applications and production: A review". Trends in Food Science & Technology, 30(1): 70-83, ISSN: 0924-2244, DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2012.11.007.). The quantification of short chain acids (SCFA) was performed by the method of Dinkci et al. (2007)Dinkci, N., Akalın, A., Gonc, S. & Una, L. G. 2007. "Isocratic Reverse-Phase HPLC for Determination of Organic Acids in Kargı Tulum Cheese". Chromatographia, 66: 45-49, ISSN: 1612-1112, DOI: https://doi.org/10.1365/s10337-007-0234-6., by means of high pressure liquid chromatography (HPLC). For this, Gemini 5u C18 110A (PHENOMENEX) column was used, with a UV light detector at 214nm, at room temperature (15 °C), with mobile phase of (NH4) 2, PO4 0.5% w/v and acetonitrile 0.4% v/v. The pH was adjusted to 2.24 with H3PO4 (filtered with a 0.22 µm pore membrane, degassed by sonication and bubbling with hydrogen) and a flow of 0.5 mL/min was applied. It was quantified with Claritychrom program, version 5.0.5.98.

The microbiological composition of fermentation samples was determined in a certified microbiological control laboratory, located in Boyacá, Colombia. For this, a 1/10 (w/v) dilution was made and the concentrations were expressed in colony forming units per milliliter (CFU/mL). Mesophilic aerobic bacteria were determined according to AOAC (966.23.C: 2001). The ISO 15213: 2003 was applied for Clostridium spores and reducing sulfite, and ISO 7954: 1987 for fungi and yeasts. Salmonella in 25 g was determined by AS 5013.10: 2009 and lactic acid bacteria by NTC 5034: 2002. For the most probable number (MPN) of total and fecal coliforms, it was proceeded according to ICMSF MPN:2000.

Experimental design and statistical analysis. For indicators pH, dry matter, crude protein, true protein and count of microorganisms, a completely randomized design was used in a 2x2x4 factorial arrangement, in which factors were fermentation time (24 and 48 h), temperature incubation (20 and 25 ºC) and percentage of calcium carbonate inclusion (0, 0.25, 0.50 and 0.75%). In the concentration of organic acids and ammonia, the same design was used with 2x2x3 arrangement, in which factors fermentation time and incubation temperature were maintained with the same levels, while the inclusion percentage of calcium carbonate did not include that of 0%. For microbial counts, the methodology proposed by Herrera et al. (2015)Herrera, M., Guerra, C.W., Torres, V. 2015. Metodología para el análisis estadístico de diferentes de tipos de variables que se miden en las investigaciones que utilizan diseños experimentales relacionados con los modelos de análisis de varianza paramétrico y no paramétrico. Ed. EDICA. Departamento de Biomatemática, Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba, ISBN: 978-959-7171-57-7. was used and the theoretical assumptions of the analysis of variance were verified. For the normality of wastes, Shapiro-Wilk (1965)Shapiro, S. & Wilk, B. 1965. "An analysis of variance test for normality (complete samples) ". Biometrika, 52(2): 591-611, ISSN: 1464-3510, DOI: http://dx.doi.org/10.2307/2333709. test was applied and Levene (1960)Levene, H. 1960. Robust tests for the equality of variance. Contributions to Probability and Statistics. 1st Ed. Ed. Stanford University Press, Palo Alto, California, USA, p. 278-292. was used for the homogeneity of variance. Variables did not meet both assumptions, so logX transformation was used, which improved their fulfillment, so a classic analysis of variance was used. For the comparison of means, Duncan (1955)Duncan, D.B. 1955. "Multiple Range and Multiple F Tests". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 0006-341X, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478. test was used for P˂0.05. Data was processed in Infostat statistical package, version 2012 (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. InfoStat version 2012 [Windows]. Grupo InfoStat, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Available: http://www.infostat.com.ar.).

Tables 2, 3, 4 and 5 show the results of chemical and microbiological characteristics of solid fermentation of post-harvest wastes of S. tuberosum, inoculated with a microbial preparation. For all indicators, interaction was detected between the factors under study (P <0.0001).

Table 2 demonstrates the effect of CaCO3 on pH during solid fermentation. It could be seen that values increased by incrementing CaCO3 percentage and incubating at 20 or 25 ºC. However, after fermentation and incubation at 20 ºC, a decrease in the indicator was observed, while at 25 ºC and CaCO3 at 0.25 and 0.50%, there were increases. Apparently, the inclusion of calcium carbonate had a positive impact on the fermentation process of potato wastes, and prevented a rapid decline that could be a limitation in growth and performance of present microorganisms, as well as in the stability of pH with its buffer properties.

It is considered that pH, temperature, shaking speed and dissolved oxygen are the indicators that most affect microbial growth (Páez et al. 2013Páez, R., Lavari, L.L., Audero, L.G., Cuatrin, L.A., Zaritzky, L.N., Reinheimer, J. & Vinderola, G. 2013. "Study of the effects of spray drying on the functionality of probiotic lactobacilli". International Journal of Dairy Technology, 66(2): 155-161, ISSN: 1471-0307, DOI: https://doi.org/10.1111/1471-0307.12038.) and functional properties (Dong et al. 2014Dong, Z., Gu, L., Zhang, J., Wang, M., Du, G., Chen, J. & Li, H. 2014. "Optimization for high cell density cultivation of Lactobacillus salivarius BBE 09-18 with response surface methodology". International Dairy Journal, 34(2): 230-236, ISSN: 0958-6946, DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2013.07.015.). The optimal values of these factors vary with the species and microbial strain, and must be correctly defined in order to obtain high yields in fermentation. One of the main reasons for the inhibition of microorganism growth is the low pH of the culture medium. Therefore, when this indicator is controlled with a base (carbonates) or an acid (organic acids), higher biomass yields can be obtained (Miranda et al. 2018Miranda, J.E., Marín, A.C., Sánchez, D.M. & García, Y.H. 2018. "Obtaining, characterization and evaluation of two candidate preparations for probiotics developed with agroindustrial waste". Revista MVZ Córdoba, 23(1): 6487-6499, ISSN: 0122-0268, DOI: https://doi.org/10.21897/rmvz.1243.). The chosen strains should also maintain their viability and activity during manufacturing, transport and storage processes (Anadón et al. 2016Anadón, A., Martínez, M.R., Arés, I., Martínez, A. & M. 2016. Prebiotics and probiotics: An assessment of their safety and health benefits. In: Watson, R.R. & Preedy, V.R. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: Bioactive foods in health promotion. 1st Ed. Ed. Academic Press. London, UK, p. 938, ISBN: 9780128023716.). In relation to temperature, most fermentations require between 30 and 37 °C to achieve optimal growth of the microorganism with lactic activity. However, LAB mixture of the microbial preparation, as a starter culture, ranged between 20 and 25 ºC, according to the experimental conditions of this study.

In the treatment without CaCO3 (0%), no appreciable values of SCFA and NH3 were detected (data not shown), so it was necessary to adjust the factorial design to 2x2x3. With respect to SCFA concentration, not significant values were also found, except for the treatment with 0.25 % CaCO3, incubated at 25 ºC for 24 h, in which 11.29 mmol/L of propionic acid was obtained. However, there was an increase of lactic acid concentration with both incubation temperatures and the course of fermentation. This effect indicates an increase of efficiency of the fermentation process, and favors quality and conservation of the final food (Zielinska et al. 2017Zielinska, K., Fabiszewska, A., Swiatek, M. & Szymanowska-Powalowska, D. 2017. "Evaluation of the ability to metabolize 1, 2-propanediol by heterofermentative bacteria of the genus Lactobacillus". Electronic Journal of Biotechnology, 26: 60-83, ISSN: 0717-3458, DOI: https://doi.org/10.1016/j.ejbt.2017.01.002.). NH3 values were low in all treatments, maybe due to this lactic acid production (table 3).

Results indicate that the use of the microbial mixture, of medium and rapid lactic fermentation, in potato post-harvest wastes and CaCO3 additive maintain favorable conditions for the production of organic acids, mainly lactic acid. According to Muck et al. (2018)Muck, R.E., Nadeau, E.M.G., McAllister, T.A., Contreras-Govea, F.E., Santos, M.C. & Kung, L. 2018. "Silage review: Recent advances and future uses of silage additives". Journal of Dairy Science, 101(5): 3980-4000, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2017-13839., Lactobacillus buchneri is the dominant species used in silage additives with BAL, obligate heterofermentative. It slowly converts lactic acid to acetic acid and 1,2-propanediol during storage in the silo, improving aerobic stability, without affecting animal productivity. However, these studies are not sufficient to determine the effects it could have on animals.

Table 4 shows the results of the microbiological analysis carried out on the fermentation of potato wastes, inoculated with the microbial preparation. By including calcium carbonate in the mixture, concentration of aerobic bacteria increased with respect to control (0%). The highest concentration was found with 0.25% carbonate and incubation at 20 ºC for 48 h. No defined performance was observed with respect to factors time, temperature and percentage of CaCO3. This result does not appear to be related to the effect of the additive or to the produced lactic acid, but rather to growth inhibition during fermentation and to the humidity of the system. Han et al. (2013)Han, B., Ujo, V., Lai, B., Gopalan, V. & Ezeji, C. 2013. "Use of proteomic analysis to elucidate the role of calcium inacetone-butanol-ethanol fermentation by Clostridium beijerinckii NCIMB 8052". Applied and Environmental Microbiology, 79(1): 282-293, ISSN: 1098-5336, DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.02969-12. stated that the addition of CaCO3 in fermentations with bacteria increases their growth. In addition, it increases the levels of sugar transporting proteins and of proteins involved in the synthesis, repair, recombination and replication of DNA. Tian et al. (2015)Tian, Q., Liang, L. & Dunca, M.J. 2015. "Enhanced biohydrogen production from sugarcane bagasse by Clostridium thermocellum supplemented with CaCO3". Bioresource Technology, 197: 422-428, ISSN: 0960-8524, DOI: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2015.08.111. obtained results with the inclusion of CaCO3 in the fermentation of sugarcane bagasse by Clostridium thermocellum and in the degradation of this substrate. They also verified its stimulating effect on biohydrogen production.

LABs, like mesophilic bacteria, increased their concentration compared to control, and a maximum of 1.7x108 CFU/ mL (8.24 log CFU/mL) was obtained with 0.50% CaCO3 in 48 h of fermentation at 25 ºC. However, they maintained concentrations of 107 CFU/mL at the two evaluated temperatures, which indicated that the inoculum, added to the microbial preparation with heterofermentative lactic bacteria, produced lactic acid in the initial period of fermentation with a decrease of pH, regardless of temperature and percentage of inclusion of carbonate as an additive. This condition causes the suppression of enterobacteria, clostridia and other microorganisms, thus reducing DM losses due to proteolysis and fermentation. According to Okubo et al. (2018)Okubo, M., Sato, K., Matsuda, S., Masuko, T. & Souma, K. 2018. "Data on chemical compositions and fermentation quality of silages made from low-market value vegetables supplemented with potato protein concentrate a byproduct of starch production". Data in Brief, 21: 11829-1832, ISSN: 2352-3409, DOI: https://doi.org/10.1016/j.dib.2018.11.043., in the active fermentation period, it is expected that pH will decrease more quickly, and to a lower value compared to an untreated or not inoculated silage, which improves protein preservation during this process.

In fermented mixtures, yeasts are in a lower proportion in relation to aerobic and lactic bacteria. At 24 h, yeast concentrations decreased with the inclusion of carbonate, without the influence of temperature. However, higher values were found for these populations at 48 h. These results may be associated with the physical-chemical components of the used sources and fermentation conditions. Yeasts appear to take longer to establish and grow in these environments, as well as in synergy with bacteria. According to Miranda et al. (2018)Miranda, J.E., Marín, A.C., Sánchez, D.M. & García, Y.H. 2018. "Obtaining, characterization and evaluation of two candidate preparations for probiotics developed with agroindustrial waste". Revista MVZ Córdoba, 23(1): 6487-6499, ISSN: 0122-0268, DOI: https://doi.org/10.21897/rmvz.1243., agroindustrial by-products (molasses, whey, soy milk and vinasse) are available sources that can be efficiently used for growth and development of microorganisms with functional activity of their metabolites. However, the combination of Lactobacillus plantarum and molasses has been demonstrated to cause a decrease of yeasts in silage as well as in ruminal fermentation (Zhao et al. 2019Zhao, J., Dong, Z., Li, J., Chen, L., Bai, Y., Jia, Y. & Shao, T. 2019. "Evaluation of Lactobacillus plantarum MTD1 and waste molasses as fermentation modifier to increase silage quality and reduce ruminal greenhouse gas emissions of rice straw". Science of the Total Environment, 20: 143-152, ISSN: 0048-9697, DOI: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.06.236.). Studies by Marrero et al. (2015)Marrero, Y., Castillo, Y., Ruiz, O., Burrola, E. & Claudio, A. 2015. "Feeding of Yeast (Candida spp.). Improves in vitro ruminal fermentation of fibrous substrates". Journal of Integrative Agriculture, 14(3): 514-519, ISSN: 2095-3119, DOI: https://doi.org/10.1016/S2095-3119(14)60830-3. report that yeasts, as efficient microorganisms in the ruminal environment, tolerate a pH range between 3 and 10, but prefer a slightly acidic medium with the addition of C molasses, as a rich source of easily fermented carbohydrates. This corresponds to the values obtained in this study for mixed populations.

Table 5 shows results of the effect of CaCO3 on protein and DM content during solid-state fermentation of post-harvest wastes of S. tuberosum, inoculated with a microbial preparation with lactic activity. With fermentation, crude protein percentage of mixtures increased in all treatments. The highest values were obtained with the inclusion of 0.50% of CaCO3, which represents a marked difference with protein contents at 25 °C, which were superior to fermentation at 20 °C, at 48 h. During this time, similar performance was found with a tendency to increase in crude protein with the addition of 0.50% of CaCO3 at 25 °C, but lower than those expected according to the results of pH and humidity of the system. However, TP/CPx100 relationship, which expresses microbial protein synthesis, was the same for temperatures of 20 oC and 25 °C with 72.76%. Therefore, under rustic or field solid fermentation conditions, it is more advisable to use temperatures of 20 oC.

With respect to DM, at 20 ºC, increases were observed in the different inclusion levels of calcium carbonate during fermentation. Although the highest value was 40.57% in 48 h, it is considered very humid to obtain a final product with the quality indicators for ruminant animals (Borras 2017Borras, L.M. 2017. Obtención de un alimento por fermentación en estado sólido de residuos de poscosecha de Solanum tuberosum para la suplementación de rumiante. PhD Thesis. Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba, p.100.). However, at 25 °C, the performance was opposite and there was no definite tendency in dry matter values ​​with the different levels of calcium carbonate, finding high and low values, ​​indistinctly. This result is due to the large amount of water still contained in potato post-harvest wastes, which makes their ensiling and preservation difficult (FAO 2015FAO-FEPALE (Food and Agriculture Organization of the United Nations, Federación Panamericana de Lechería) 2012. Situación de la lechería en América Latina y el Caribe en el 2011. Informe producido en el ámbito del Observatorio de la Cadena láctea de América Latina y el Caribe. Observatorio de la Cadena Lechera, Oficina Regional de la FAO para América Latina y el Caribe, División de Producción y Sanidad Animal.). Thus, a suitable medium is provided for the development of microorganisms, which alter the material and can be pathogenic for animals. However, in the current study, concentration of lactic acid and the maintenance of low pH allowed the removal of undesirable microorganisms.

The performance of chemical indicators of food indicated that when the potato is cut, it quickly begins a leaching process, which leads to significantly wetting food and altering its organoleptic characteristics and conservation. Urea hydrolysis by bacteria within fermentation in its metabolic process of cellular synthesis produces water and ammonia. This could be volatilized depending on final pH of the process and, possibly, on the deamination of peptides and amino acids, on a smaller scale. Part of the water produced during the oxidation of molecules could be evaporated by the metabolic heat generated during the SSF process (Pandey et al. 2001Pandey, A., Soccol, C.R., Rodríguez-León, J.A. & Nee-Nigam, P.S. 2001. Solid-state fermentation in Biotechnology. Fundamentals and Applications. Reference Book. Ed. Asiatech Publishers, Inc. New Delhi, India, p. 221, ISBN: 81-87680-06-7. and Mitchell et al. 2002Mitchell, A., Berovic, M. & Krieger, N. 2002. "Overview of solid state bioprocessing". Biotechnology Annual Review, 8: 183-225, ISSN: 1387-2656, DOI: https://doi.org/10.1016/S1387-2656(02)08009-2.). However, in the previously mentioned studies, these processes did not significantly influence final dry matter, so the fermentation mixture still maintains high values ​​for the fermentation process to be effective.

True protein demonstrated an increase of 4.98 percentage units with respect to the microbial preparation (8.85%) as a biological accelerator in fermentation, according to Borras (2017)Borras, L.M. 2017. Obtención de un alimento por fermentación en estado sólido de residuos de poscosecha de Solanum tuberosum para la suplementación de rumiante. PhD Thesis. Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba, p.100. for the temperature of 20 oC during 24 h of fermentation. These values ​​are maintained with differences with respect to calcium carbonate levels at 48 h, so this compound favored the microbial synthesis of concentration of the initial CFU/mL. Siebald et al. (2002)Siebald, E., Goic, L. & Matzner, M. 2002. Alimentación de rumiantes con papa de desecho. In: Boletín Técnico N° 88, Instituto de Investigaciones Agropecuarias-Centro Regional de Investigaciones Remehue. Available: <http://www.produccion-animal.com.ar/informacion_tecnica/suplementacion/99-papa.pdf>, [Consulted: January 27th, 2014]. highlighted that around 50% of crude protein belongs to non-protein nitrogenous compounds. One of them is solanidine, an alkaloid that can be present, free or combined in the form of glycoalkaloids, called chaconine and solanine, both toxic to animals. These compounds are eliminated by solid-state fermentation, since most of the protein of this study has microbial origin, and does not come directly from food.

Results of chemical and microbiological indicators evidenced that other raw materials with a high DM proportion should be evaluated, so that they allow to create a mixture for ensiling, with a percentage close to that recommended for animal feed.

It is concluded that the inclusion of 0.50% of CaCO3, at 20 °C during 24 h of fermentation of post-harvest wastes of S. tuberosum with the microbial preparation, maintains favorable conditions for the production of organic acids and the aerobic stability of fermentation. Other plant materials are recommended to increase DM content of the final product.

El experimento de fermentación en estado sólido (FES) se realizó en las condiciones del trópico alto (2860 msnm), en el laboratorio de bioquímica y nutrición animal de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (UPTC), ubicado en la avenida Central del Norte, vía Tunja-Paipa, en el municipio de Tunja, departamento de Boyacá, Colombia. Esta región tiene una temperatura promedio de 15 °C y precipitación media anual de 553 mm.

Procedimiento experimental. Se elaboró un yogurt con las cepas activas de Lactobacillus delbrueckiis ssp bulgaricus y Streptococcus thermophilus (comercial liofilizado, Liofast Y452B, SACCO ®), que se empleó como inóculo (2 %, v/v y concentración de 0.99 x 108 UFC/mL) para la obtención del preparado microbiano, según la metodología de Borras (2017)Borras, L.M. 2017. Obtención de un alimento por fermentación en estado sólido de residuos de poscosecha de Solanum tuberosum para la suplementación de rumiante. PhD Thesis. Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba, p.100.. Este preparado (2 %) se mezcló a temperatura ambiente (15 ± 2 ºC) con urea (1 %), premezcla mineral (0.50 %), sulfato de sodio (0.50 %), carbonato de calcio y residuos poscosecha de la papa, previamente limpios y troceados. El porcentaje de inclusión del carbonato de calcio (CaC03) varió según los tratamientos experimentales (0; 0.25; 0.50 y 0.75 %).

En la tabla 1 se presenta la composición de las mezclas elaboradas en las condiciones citadas (0 h y 15 ºC). Estas se distribuyeron en bolsas plásticas, con capacidad de 1 kg. Cada bolsa se consideró una unidad experimental, con tres repeticiones por tratamiento. Se dividieron en dos grupos y se incubaron a 20 y 25 ºC respectivamente, en incubadoras individuales marca Memmert® durante 48 h. Se tomaron muestras a las 24 y 48 h de fermentación para determinar indicadores químicos y microbiológicos.

El contenido de las bolsas de cada tratamiento (tres repeticiones) se recolectó y homogenizó. Luego, se tomaron 5 g de muestra y se colocaron en Erlenmeyer de 100 mL. Posteriormente, se les adicionó 45 mL de agua destilada estéril. La preparación se agitó durante 30 min. en un agitador eléctrico marca Adams®. Más tarde, se obtuvo el filtrado para medir pH, concentración de ácidos orgánicos, amoniaco, y además realizar el análisis microbiológico.

Los sólidos se secaron en estufa a 60 ºC y se molieron en un molino de martillo, marca UDY®, con criba de 1 mm, para el análisis de cuantificación química. Para determinar la materia seca (MS) y proteína bruta (PB) se procedió según la AOAC (2005)AOAC (Association of Official Analytical Chemists). 2005. Official Methods of Analysis 18th Ed. Ed. Association of Officiating Analytical Chemists. Washington D.C., U.S.A, ISBN: 978-093-5584-752., y para proteína verdadera (PV), se siguió a Berstein, citado por Meir (1986)Meir, H. 1986. Laborproktibuire. Tierernährung Und, futtermittel für Tiere Produzenten. 45: 3. Verlag, Berlin, Germany..

El pH se midió en un potenciómetro automático marca Okaton® y el amoniaco (NH3) se determinó por la técnica de Berthelot (Martínez et al. 2003Martínez, F., Balciunas, E., Salgado, J., González, J., Converti, A. & Oliveira, R. 2003. "Lactic acid properties, applications and production: A review". Trends in Food Science & Technology, 30(1): 70-83, ISSN: 0924-2244, DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2012.11.007.). La cuantificación de ácidos de cadena corta (AGCC) se realizó por el método de Dinkci et al. (2007)Dinkci, N., Akalın, A., Gonc, S. & Una, L. G. 2007. "Isocratic Reverse-Phase HPLC for Determination of Organic Acids in Kargı Tulum Cheese". Chromatographia, 66: 45-49, ISSN: 1612-1112, DOI: https://doi.org/10.1365/s10337-007-0234-6., por medio de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). Para ello se utilizó la columna Gemini 5u C18 110A (PHENOMENEX), con detector de luz UV vis a 214nm, a temperatura ambiente (15°C), con fase móvil de (NH4)2, PO4 0.5% P/V y acetonitrilo 0.4%V/V. Se ajustó pH a 2.24 con H3PO4 (filtrada con membrana de 0.22 µm de poro, desgasificada por sonicación y burbujeo con hidrógeno) y se aplicó un flujo de 0.5 mL/min. Se cuantificó con el programa Claritychrom, versión 5.0.5.98.

La composición microbiológica de las muestras de fermentación se determinó en un laboratorio certificado de control microbiológico, ubicado en Boyacá, Colombia. Para esto se realizó una dilución 1/10 (p/v) y las concentraciones se expresaron en unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL). Las bacterias aerobias mesófilos se determinaron según AOAC (966.23.C: 2001). Para las esporas de Clostridium y sulfito reductor se aplicó ISO 15213:2003, y para hongos y levaduras ISO 7954:1987. La Salmonella en 25 g se determinó por AS 5013.10:2009 y las bacterias ácido lácticas por NTC 5034: 2002. Para el número más probable (NMP) de coliformes totales y fecales se procedió según ICMSF NMP: 2000.

Diseño experimental y análisis estadístico. Para los indicadores pH, materia seca, proteína bruta, proteína verdadera y conteo de microorganismos, se utilizó un diseño completamente aleatorizado en arreglo factorial 2x2x4, donde los factores fueron tiempo de fermentación (24 y 48 h), temperatura de incubación (20 y 25 ºC) y porcentaje de inclusión del carbonato de calcio (0; 0.25; 0.50 y 0.75 %). En la concentración de ácidos orgánicos y amoniaco se empleó el mismo diseño con arreglo (2x2x3), donde los factores tiempo de fermentación y temperatura de incubación se mantuvieron con los mismos niveles, mientras que el porcentaje de inclusión del carbonato de calcio no incluyó el de 0%. Para los conteos microbianos se utilizó la metodología propuesta por Herrera et al. (2015)Herrera, M., Guerra, C.W., Torres, V. 2015. Metodología para el análisis estadístico de diferentes de tipos de variables que se miden en las investigaciones que utilizan diseños experimentales relacionados con los modelos de análisis de varianza paramétrico y no paramétrico. Ed. EDICA. Departamento de Biomatemática, Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba, ISBN: 978-959-7171-57-7. y se verificaron los supuestos teóricos del análisis de varianza. Para la normalidad de los residuos se aplicó la dócima de Shapiro-Wilk (1965)Shapiro, S. & Wilk, B. 1965. "An analysis of variance test for normality (complete samples) ". Biometrika, 52(2): 591-611, ISSN: 1464-3510, DOI: http://dx.doi.org/10.2307/2333709. y para la homogeneidad de varianza, Levene (1960)Levene, H. 1960. Robust tests for the equality of variance. Contributions to Probability and Statistics. 1st Ed. Ed. Stanford University Press, Palo Alto, California, USA, p. 278-292.. Las variables incumplieron ambos supuestos, por lo que se empleó la transformación logX, que mejoró su cumplimiento, por lo que se empleó un análisis de varianza clásico. Para la comparación de medias se utilizó la dócima de Duncan (1955)Duncan, D.B. 1955. "Multiple Range and Multiple F Tests". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 0006-341X, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478. para P ˂ 0.05. Los datos se procesaron en el paquete estadístico Infostat, versión 2012 (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. InfoStat version 2012 [Windows]. Grupo InfoStat, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Available: http://www.infostat.com.ar.).

En las tablas 2, 3, 4 y 5 se muestran los resultados de las características químicas y microbiológicas de la fermentación sólida de residuos poscosecha de S. tuberosum, inoculado con un preparado microbiano. Para todos los indicadores, se detectó interacción entre los factores en estudio (P<0.0001).

En la tabla 2 se presenta el efecto del CaCO3 en el pH durante la fermentación sólida. Se pudo ver que los valores se incrementaron al aumentar el porcentaje de CaCO3 e incubar a 20 o 25 ºC. Sin embargo, al transcurrir la fermentación e incubar a 20 ºC se observó disminución del indicador; mientras que a 25 ºC y CaCO3 al 0.25 y 0.50 % hubo incrementos. Al parecer, la inclusión del carbonato de calcio tuvo incidencia positiva en el proceso fermentativo de los residuos de la papa, y evitó un descenso rápido que pudiera ser una limitación en el crecimiento y comportamiento de los microorganismos presentes, así como en la estabilidad del pH con su poder amortiguador.

Se considera que el pH, temperatura, velocidad de agitación y oxígeno disuelto son los indicadores que más inciden en el crecimiento microbiano (Páez et al. 2013Páez, R., Lavari, L.L., Audero, L.G., Cuatrin, L.A., Zaritzky, L.N., Reinheimer, J. & Vinderola, G. 2013. "Study of the effects of spray drying on the functionality of probiotic lactobacilli". International Journal of Dairy Technology, 66(2): 155-161, ISSN: 1471-0307, DOI: https://doi.org/10.1111/1471-0307.12038.) y las propiedades funcionales (Dong et al. 2014Dong, Z., Gu, L., Zhang, J., Wang, M., Du, G., Chen, J. & Li, H. 2014. "Optimization for high cell density cultivation of Lactobacillus salivarius BBE 09-18 with response surface methodology". International Dairy Journal, 34(2): 230-236, ISSN: 0958-6946, DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2013.07.015.). Los valores óptimos de estos factores varían con la especie y cepa microbiana y deben estar correctamente definidos para que se obtengan altos rendimientos en la fermentación. Una de las principales razones de la inhibición del crecimiento de microorganismos es el bajo pH del medio de cultivo. Por eso, cuando se controla este indicador con una base (carbonatos) o un ácido (ácidos orgánicos) se pueden obtener mayores rendimientos de biomasa (Miranda et. al. 2018Miranda, J.E., Marín, A.C., Sánchez, D.M. & García, Y.H. 2018. "Obtaining, characterization and evaluation of two candidate preparations for probiotics developed with agroindustrial waste". Revista MVZ Córdoba, 23(1): 6487-6499, ISSN: 0122-0268, DOI: https://doi.org/10.21897/rmvz.1243.). Las cepas elegidas deben mantener, además, su viabilidad y actividad durante los procesos de fabricación, transporte y almacenamiento (Anadón et al. 2016Anadón, A., Martínez, M.R., Arés, I., Martínez, A. & M. 2016. Prebiotics and probiotics: An assessment of their safety and health benefits. In: Watson, R.R. & Preedy, V.R. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: Bioactive foods in health promotion. 1st Ed. Ed. Academic Press. London, UK, p. 938, ISBN: 9780128023716.). En relación con la temperatura, la mayoría de las fermentaciones requieren entre 30 y 37 °C para lograr el crecimiento óptimo del microrganismo con actividad láctica. Sin embargo, la mezcla de BAL del preparado microbiano, como cultivo iniciador, osciló entre 20 y 25 ºC, según las condiciones experimentales de este estudio.

En el tratamiento donde no se incluyó CaCO3 (0 %) no se detectaron valores apreciables de AGCC y NH3 (datos no mostrados), por lo que fue necesario ajustar el diseño factorial a 2x2x3. Con respecto a la concentración de AGCC, se encontraron también valores despreciables, excepto para el tratamiento con 0.25 % de CaCO3, incubado a 25 ºC por 24 h, donde se obtuvo 11.29 mmol/L de ácido propiónico. Sin embargo, hubo incremento de la concentración del ácido láctico con ambas temperaturas de incubación y el transcurso de la fermentación. Este efecto indica un aumento de la eficiencia del proceso fermentativo y favorece la calidad y conservación del alimento final (Zielinska et al. 2017Zielinska, K., Fabiszewska, A., Swiatek, M. & Szymanowska-Powalowska, D. 2017. "Evaluation of the ability to metabolize 1, 2-propanediol by heterofermentative bacteria of the genus Lactobacillus". Electronic Journal of Biotechnology, 26: 60-83, ISSN: 0717-3458, DOI: https://doi.org/10.1016/j.ejbt.2017.01.002.). Los valores de NH3 fueron bajos en todos los tratamientos, quizás debido a esta producción de ácido láctico (tabla 3).

Los resultados indican que el uso de la mezcla microbiana, de mediana y rápida fermentación láctica, en los desechos poscosecha de la papa y el aditivo CaCO3 mantienen las condiciones favorables para la producción de ácidos orgánicos, fundamentalmente láctico. Según Muck et al. (2018)Muck, R.E., Nadeau, E.M.G., McAllister, T.A., Contreras-Govea, F.E., Santos, M.C. & Kung, L. 2018. "Silage review: Recent advances and future uses of silage additives". Journal of Dairy Science, 101(5): 3980-4000, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2017-13839., Lactobacillus buchneri es la especie dominante utilizada en aditivos de ensilaje con BAL, heterofermentativos obligados. Convierte lentamente el ácido láctico en ácido acético y 1,2-propanodiol durante el almacenamiento en el silo, lo que mejora la estabilidad aeróbica, sin afectar la productividad animal. No obstante, estas investigaciones no son suficientes para determinar los efectos que pudiera tener en los animales.

En la tabla 4 se muestran los resultados del análisis microbiológico realizado a la fermentación de los residuos de la papa, inoculada con el preparado microbiano. Al incluir carbonato de calcio en la mezcla, aumentó la concentración de bacterias aerobias con respecto al control (0 %). La mayor concentración se encontró con 0.25 % de carbonato e incubación a 20 ºC durante 48 h. No se observó un comportamiento definido con respecto a los factores tiempo, temperatura y porcentaje de CaCO3. Este resultado no parece estar relacionado con el efecto del aditivo ni con el ácido láctico producido, sino con la inhibición del crecimiento durante la fermentación y con la humedad del sistema. Han et al. (2013)Han, B., Ujo, V., Lai, B., Gopalan, V. & Ezeji, C. 2013. "Use of proteomic analysis to elucidate the role of calcium inacetone-butanol-ethanol fermentation by Clostridium beijerinckii NCIMB 8052". Applied and Environmental Microbiology, 79(1): 282-293, ISSN: 1098-5336, DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.02969-12. comprobaron que la adición de CaCO3 en fermentaciones con bacterias incrementa el crecimiento de estas. Además, aumenta los niveles de proteínas transportadoras de azúcar y de proteínas involucradas en la síntesis, reparación, recombinación y replicación del ADN. Tian et al. (2015)Tian, Q., Liang, L. & Dunca, M.J. 2015. "Enhanced biohydrogen production from sugarcane bagasse by Clostridium thermocellum supplemented with CaCO3". Bioresource Technology, 197: 422-428, ISSN: 0960-8524, DOI: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2015.08.111. obtuvieron resultados con la inclusión de CaCO3 en la fermentación del bagazo de caña de azúcar por Clostridium termocellum y en la degradación de este sustrato. Comprobaron, además, su efecto estimulador en la producción de biohidrógeno.

Las BAL, al igual que las bacterias mesófilas, incrementaron su concentración con respecto al control, y se obtuvo un máximo de 1,7x108 UFC/mL (8.24 log UFC/mL) con 0.50 % de CaCO3 en 48 h de fermentación a 25 ºC. Sin embargo, mantuvieron concentraciones de 107 UFC/mL a las dos temperaturas evaluadas, lo que indica que el inóculo añadido en el preparado microbiano con bacterias lácticas heterofermentativas produce ácido láctico en el período inicial de la fermentación con disminución del pH, independientemente de la temperatura y el porcentaje de inclusión del carbonato como aditivo. Esta condición provoca la supresión de enterobacterias, clostridios y otros microorganismos, y así se reducen las pérdidas de MS por proteólisis y fermentación. Según Okubo et al. (2018)Okubo, M., Sato, K., Matsuda, S., Masuko, T. & Souma, K. 2018. "Data on chemical compositions and fermentation quality of silages made from low-market value vegetables supplemented with potato protein concentrate a byproduct of starch production". Data in Brief, 21: 11829-1832, ISSN: 2352-3409, DOI: https://doi.org/10.1016/j.dib.2018.11.043., en el período de fermentación activa se espera que el pH baje más rápidamente, y a un valor inferior con respecto a un ensilaje no tratado ni inoculado, lo que mejora la preservación de la proteína durante este proceso.

En las mezclas fermentadas, las levaduras están en menor proporción en relación con las bacterias aerobias y lácticas. A las 24 h, disminuyeron las concentraciones de levaduras con la inclusión del carbonato, sin influencia de la temperatura. Sin embargo, a las 48 h se encontraron valores superiores de estas poblaciones. Estos resultados quizás estén asociados a los componentes físico-químicos de las fuentes utilizadas y a las condiciones de la fermentación. Al parecer, las levaduras necesitan mayor tiempo para establecerse y crecer en estos ambientes, así como en sinergia con las bacterias. Según Miranda et al. (2018)Miranda, J.E., Marín, A.C., Sánchez, D.M. & García, Y.H. 2018. "Obtaining, characterization and evaluation of two candidate preparations for probiotics developed with agroindustrial waste". Revista MVZ Córdoba, 23(1): 6487-6499, ISSN: 0122-0268, DOI: https://doi.org/10.21897/rmvz.1243., los subproductos agroindustriales (melaza, suero de leche, leche soya, vinaza) son fuentes disponibles que se pueden emplear de forma eficiente para el crecimiento y desarrollo de microorganismos con actividad funcional de sus metabolitos. Sin embargo, se ha demostrado que la combinación de Lactobacillus plantarum y melaza provoca disminución de las levaduras en el ensilaje como en la fermentación ruminal (Zhao et al. 2019Zhao, J., Dong, Z., Li, J., Chen, L., Bai, Y., Jia, Y. & Shao, T. 2019. "Evaluation of Lactobacillus plantarum MTD1 and waste molasses as fermentation modifier to increase silage quality and reduce ruminal greenhouse gas emissions of rice straw". Science of the Total Environment, 20: 143-152, ISSN: 0048-9697, DOI: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.06.236.). Estudios de Marrero et al. (2015)Marrero, Y., Castillo, Y., Ruiz, O., Burrola, E. & Claudio, A. 2015. "Feeding of Yeast (Candida spp.). Improves in vitro ruminal fermentation of fibrous substrates". Journal of Integrative Agriculture, 14(3): 514-519, ISSN: 2095-3119, DOI: https://doi.org/10.1016/S2095-3119(14)60830-3. refieren que las levaduras, como microorganismos eficientes en el ambiente ruminal, toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero prefieren un medio ligeramente ácido con la adición de miel C de caña de azúcar, como fuente rica en carbohidratos de fácil fermentación. Esto se corresponde con los valores obtenidos en esta investigación para poblaciones mixtas.

En la tabla 5 se presentan los resultados del efecto del CaC03, en el contenido de proteína y MS durante la fermentación en estado sólido de residuos poscosecha de S. tuberosum inoculado con un preparado microbiano con actividad láctica. Con la fermentación, el porcentaje de proteína bruta de las mezclas aumentó en todos los tratamientos. Los valores más altos se obtuvieron con la inclusión de 0.50% de CaCO3, lo que representa una diferencia marcada con los tenores de proteína a los 25°C, los que estuvieron porcentualmente por encima de la fermentación a los 20°C, a las 48 h. En este tiempo se encontraron comportamientos similares con una tendencia al incremento en la proteína bruta con la adición de 0.50 % de CaCO3 a los 25°C, pero más bajos que los esperados según los resultados del pH y la humedad del sistema. Sin embargo, la relación de PV/PBx100, que expresa la síntesis de proteína microbiana, fue la misma para las temperaturas de 20 oC y 25°C con 72.76 %. Por tanto, en condiciones de fermentación sólida rústica o de campo, es más recomendable utilizar temperaturas de 20oC.

Con respecto a la MS, a la temperatura de 20 ºC se observaron incrementos en los distintos niveles de inclusión del carbonato de calcio durante la fermentación. Aunque el mayor valor fue de 40.57 % en 48 h, se considera muy húmedo para obtener un producto final con los indicadores de calidad para animales rumiantes (Borras 2017Borras, L.M. 2017. Obtención de un alimento por fermentación en estado sólido de residuos de poscosecha de Solanum tuberosum para la suplementación de rumiante. PhD Thesis. Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba, p.100.). Sin embargo, a temperatura de 25°C, el comportamiento fue opuesto y se observó que no hubo tendencia definida en los valores de materia seca con los diferentes niveles de carbonato de calcio, encontrándose valores altos y bajos indistintamente. Este resultado se debe a la gran cantidad de agua que aún contienen los residuos de poscosecha de la papa, lo que dificulta su ensilado y preservación (FAO 2015FAO-FEPALE (Food and Agriculture Organization of the United Nations, Federación Panamericana de Lechería) 2012. Situación de la lechería en América Latina y el Caribe en el 2011. Informe producido en el ámbito del Observatorio de la Cadena láctea de América Latina y el Caribe. Observatorio de la Cadena Lechera, Oficina Regional de la FAO para América Latina y el Caribe, División de Producción y Sanidad Animal.). Se provee así de un medio adecuado para el desarrollo de microorganismos, que alteran el material y que pueden ser patógenos para los animales. Sin embargo, en este estudio, la concentración de ácido láctico y el mantenimiento del pH bajo posibilitaron la eliminación de microorganismos indeseables.

El comportamiento de los indicadores químicos del alimento indicó que la papa al ser cortada inicia rápidamente un proceso de lixiviación, lo que lleva a humedecer sensiblemente el alimento y a alterar sus características organolépticas y conservación. La hidrólisis de la urea por bacterias presentes en la fermentación en su proceso metabólico de síntesis celular produce agua y amoníaco. Este se pudiera volatilizar en dependencia del pH final del proceso y, posiblemente, de la desaminación de péptidos y aminoácidos, en menor escala. Parte del agua producida durante la oxidación de las moléculas se pudiera evaporar por el calor metabólico generado durante el proceso de FES (Pandey et al. 2001Pandey, A., Soccol, C.R., Rodríguez-León, J.A. & Nee-Nigam, P.S. 2001. Solid-state fermentation in Biotechnology. Fundamentals and Applications. Reference Book. Ed. Asiatech Publishers, Inc. New Delhi, India, p. 221, ISBN: 81-87680-06-7. y Mitchell et al. 2002Mitchell, A., Berovic, M. & Krieger, N. 2002. "Overview of solid state bioprocessing". Biotechnology Annual Review, 8: 183-225, ISSN: 1387-2656, DOI: https://doi.org/10.1016/S1387-2656(02)08009-2.). Sin embargo, en los estudios citados estos procesos no influyeron significativamente en la materia seca final, por lo que la mezcla de fermentación mantiene valores todavía altos para que el proceso fermentativo sea efectivo.

La proteína verdadera mostró incremento de 4.98 unidades porcentuales con respecto al preparado microbiano (8.85%) como acelerador biológico en la fermentación, según refiere Borras (2017)Borras, L.M. 2017. Obtención de un alimento por fermentación en estado sólido de residuos de poscosecha de Solanum tuberosum para la suplementación de rumiante. PhD Thesis. Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba, p.100. para la temperatura de 200C durante 24 h de fermentación. Estos valores se mantienen con diferencias con respecto a los niveles de carbonato de calcio a las 48 h, por lo que este compuesto favoreció la síntesis microbiana de la concentración en UFC/mL inicial. Siebald et al. (2002)Siebald, E., Goic, L. & Matzner, M. 2002. Alimentación de rumiantes con papa de desecho. In: Boletín Técnico N° 88, Instituto de Investigaciones Agropecuarias-Centro Regional de Investigaciones Remehue. Available: <http://www.produccion-animal.com.ar/informacion_tecnica/suplementacion/99-papa.pdf>, [Consulted: January 27th, 2014]. resaltan que, aproximadamente, 50 % de la proteína bruta corresponde a compuestos nitrogenados no proteicos. Uno de ellos es la solanidina, alcaloide que puede estar presente libre o combinado en forma de glicoalcaloides, denominados chaconina y solanina, ambos tóxicos para los animales. Estos compuestos se eliminan por la fermentación en estado sólido, pues en este estudio la mayoría de la proteína es de origen microbiano, y no proviene directamente del alimento.

Los resultados de los indicadores químicos y microbiológicos indicaron que se deben valorar otras materias primas con alta proporción de MS, de modo que permitan crear una mezcla para ensilar, con un porcentaje cercano al recomendado para alimento animal.

Se concluye que la inclusión de 0.50 % de CaCO3, a temperatura de 20 °C durante 24 h de fermentación de los residuales poscosecha de S. tuberosum con el preparado microbiano, mantiene las condiciones favorables para la producción de ácidos orgánicos y la estabilidad aeróbica de la fermentación. Se recomiendan otros materiales vegetales para aumentar el contenido de la MS del producto final.