Silage obtaining

Forages used for silage production. Plants were collected in experimental areas of the Institute of Animal Science (ICA) of Cuba. Plants of C. purpureus x C. glaucum (OM-22 hybrid) and M. oleifera (moringa) of 90 and 60 days of age, respectively, were collected by manual cut. They were established in typical red ferralitic soil, fast drying and uniform profile (Hernández et al. 2015Hernández, A., Pérez, J.M., Bosch, D. & Castro, N. 2015. Clasificación de los suelos de Cuba. Ed. INCA. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, p. 93, ISBN: 978-959-7023-77-7. ). Both forages were passed through a forage mill until they reached a particle size of 20-30 mm and ground material was spread for pre-drying under the sun on a flat surface with drainage until reaching a DM superior to 30%.

Additives used for silage production. Sweet potato tubers were used as energy additives to increase the content of easily fermented carbohydrates. Small and medium-sized sweet potatoes were used, without washing, but without adhering soil. Tubers were cut lengthwise into pieces, and, then, they were reduced in size by thinly laminating them. This process was carried out at the time silages were prepared to avoid starch oxidation as much as possible.

The pure culture of the strain of lactic acid bacteria P. pentosaceus LB-25 was used as microbial additive, obtained from the ICA Bank of Microorganisms. This strain was identified by sequencing the ribosomal RNA 16S gene and its sequence is deposited at GenBank (access number: FR717465). The strain was grown in Rogosa broth (Oxoid, UK), at 37 °C, for 18-24 h. After incubation period, its purity was verified and concentrations of 109 cells·mL-1 were guaranteed, determined by counting in a Neubauer chamber.

Microsilos preparation. Microsilos preparation was carried out according to the methodology proposed by Rodríguez et al. (2016)Rodríguez, R., Elías, A., Herrera, F., González, N., Moreira, O., Gutiérrez, D., Gómez, S., Sarduy, L. & Medina, Y. 2016. "Valor nutritivo de ensilajes mixtos Pennisetum purpureum (vc. CUBA CT-169): Moringa oleifera: Ipomoea batata, inoculados con el producto biológico VITAFERT". Available: <http://www.engormix.com/MA-ganaderia-carne/nutricion/articulos/cuba2015-valor-nutritivo-ensilajes-t39536/141-p0.htm>, [Consulted: April 25th, 2020]. in hermetically sealed glass tubes (120 mm height x 70 mm diameter). First, a mixture was prepared with the forages to be ensiled (OM-22 and moringa, 50:50 in humid base), which constituted the fiber and protein core of silages to be evaluated. Later, this core was mixed with the three levels of sweet potato tubers (0, 25 and 50%) and then, all treatments were uniformLy sprayed with urea (1%) and ammonium sulfate (0.2%), diluted in water at a proportion of 1: 2, also on a humid base. After mixing with urea and ammonium sulfate, it was left to rest for 30 minutes before adding the microbial inoculum to treatments. For this inoculation, 75 mL of medium with the corresponding inoculum for each 1.5 kg of the material to be ensiled were sprayed for each combination of forage and sweet potato (5% v/w). Treatments without microbial inoculum were sprayed with the same amount of distilled water to ensure that all treatments were homogeneously moistened.

After a last mixing, treatments were introduced into glass containers, in layers that were compacted with a tamper tool. At the end, containers were hermetically sealed. Microsilos, with approximately 300 g of fresh matter, were kept under anaerobic conditions for a period of 64 days. The evaluated treatments were:

At the end of silage process, microsilos were opened and a sample of 10 g was taken from each, 90 mL of distilled water was added and it was mixed in orbital shaker at 250 rpm for 15 minutes, at 20ºC. Then, the mixture was filtered through gauze and pH was measured to the filtrate (Everich pH meter, PHSJ-3F, China). Additionally, approximately 200 g were taken from each microsilo, they were dried to constant weight in a forced air oven, with regulated temperature (60ºC) and then they were ground in a hammer mill until reaching a particle size of 1 mm. Subsequently, half of the dry material from each microsilo was individually stored in sealed nylon bags for chemical composition analysis. The rest of dry material was homogeneously mixed by treatment and the obtained pool was also stored in sealed nylon bags until it was used for in vitro evaluations.

In vitro evaluation of the fermentative capacity of the obtained silages. Two in vitro tests were performed to evaluate the nutritional value of the obtained mixed silages, in which gas production technique described by Theodorou et al. (1994)Theodorou, M.K., Williams, B., Dhanoa, M., McAllan, A.B. & France, J. 1994. "A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feeds". Animal Feed Science and Technology, 48(3-4): 185-197, ISSN: 0377-8401, DOI: https://doi.org/10.1016/0377-8401(94)90171-6. was used. An amount of 1.0 g of each treatment was incubated in 100 mL glass bottles, with culture medium (Menke and Steingass 1988Menke, K.H. & Steingass, H. 1988. "Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid". Animal Research and Development, 28: 7-55, ISSN: 0340-3165.) and an inoculum of ruminal microorganisms in a proportion of 0.20 mL of the total incubation volume (80 mL).

Ruminal content of two stabulated adult Siboney cows, fed ad libitum with grass forage and free access to water and mineral salts, was used as inoculum. Rumen content was collected through the rumen cannula, before offering food in the morning, and it was kept in independent closed thermoses until reaching the laboratory, where they were filtered through gauze and mixed in equal proportions. During the process, inocula temperature was maintained at 39 ± 1ºC, and anaerobic conditions by continuous flow of CO2. Bottles were sealed and incubated in a bath, at controlled temperature (39ºC). This moment was taken as zero hour of incubation. In both tests, bottles without substrate were incubated as control.

In the first test, to determine in vitro fermentation kinetics of obtained silages, gas production was measured up to 144 h, using an HD8804 manometer coupled to a TP804 pressure calibrator (DELTA OHM, Italy). After each measurement, gas was released to equalize the external and internal pressures of bottles. Gas volume was estimated from pressure data, using a pre-established linear regression equation (Rodríguez et al. 2013Rodríguez, R., Lores, J., Gutiérrez, D., Ramírez, A., Gómez, S., Elías, A., Aldana, A.I., Moreira, O., Sarduy, L. & Jay, O. 2013. "Inclusion of the microbial additive Vitafert in the in vitro ruminal fermentation of a goat diet". Cuban Journal of Agricultural Science, 47(2): 171-178, ISSN: 2079-3480.). Gas volume was expressed per gram of incubated organic matter (incOM). To estimate gas production kinetics, the exponential model described by Krisnamoorthy et al. (1991)Krishnamoorthy, U., Soller, H., Steingass, H. & Menke, K.H. 1991. "A comparative study on rumen fermentation of energy supplements in vitro". Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 65(1-5): 28-35, ISSN: 1439-0396, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1439-0396.1991.tb00237.x. was used:

Where Y is accumulated gas production (mL g-1 incOM) at an incubation time t (h), D is fermentation potential of the substrate under incubation conditions (asymptote of the curve, mL g-1 incOM), c is fermentation fractional rate of (h-1) and L is the Lag phase of fermentation (h).

In the second test, gas production was measured only up to 24 hours of incubation (3, 6, 9, 12, 18, and 24 h). At the end of incubation, bottles were opened and their contents were filtered to nylon bags (50 μm of porosity and 28 cm2 of surface area​​), previously tared in an analytical balance (Sartorius BL 1,500 ± 0.0001). Bags with fermentation residues were dried up through constant weight in a forced air oven with regulated temperature at 60ºC, for 72 hours. By this means, apparent in vitro degradability of DM (DAIVMS) of evaluated silages was determined by gravimetry, as the difference between incubated substrate and fermentation residue, expressed as a proportion of incubated substrate and multiplied by 100 (%).

In addition, 5 mL of sample were taken from the filtrate to determine the NH3 content, which were preserved until the time of their analysis.

Chemical analysis. To determine the chemical composition of silages, DM, OM and crude protein (CP) were determined (AOAC 2016AOAC (Association of Official Analytical Chemists). 2016. Official Methods of Analysis of AOAC International. 20th Ed. George W. Latimer Jr (ed). Ed. AOAC International, Rockville MD, USA, ISBN: 978-0935-584-875.). Neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) were quantified by the procedure described by Van Soest et al. (1991)Van Soest, P.J., Robertson, J.B. & Lewis, B.A. 1991. "Methods for Dietary Fiber, Neutral Detergent Fiber, and Nonstarch Polysaccharides in Relation to Animal Nutrition". Journal of Dairy Science, 74(10): 3583-3597, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(91)78551-2.. To obtain ammonia concentration in the in vitro test, the colorimetric technique proposed by Chaney and Marbach (1962)Chaney, A.L. & Marbach, E.P. 1962. "Modified reagents for determination of urea and ammonia". Clinical Chemistry, 8(2): 130-132, ISSN: 0009-9147, DOI: https://doi.org/10.1093/clinchem/8.2.130. was used.

Statistical analysis. For the analysis of chemical composition of evaluated silages, a completely randomized experimental design, with a factorial arrangement (3x2), was used, in which the main factors were the 3 levels of sweet potato inclusion (0, 25 and 50%) and the inclusion of microbial additive (without additive and with P. pentosaceus LB-25). Microsilos were considered as an experimental unit (5).

In the 24 h in vitro trial, a randomized block design with a factorial arrangement (3x2) was used, where analyzed factors were the same as in the previous case and incubations were considered as a block (4). In this experiment, bottles were considered as an experimental unit (3 bottles per treatment).

In both cases, variables were analyzed by ANOVA. In case differences were found (P <0.05), means of treatments were compared by Duncan (1955)Duncan, D.B. 1955. "Multiple Range and Multiple F Tests". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 0006-341X, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478. test. InfoStat statistical package (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. InfoStat. version 2012, [Windows], Universidad Nacional de Córdoba, Argentina: Grupo InfoStat. Available: http://www.infostat.com.ar ) was used for these analyzes.

In the case of the variable in vitro accumulated gas production, the fermentation was divided a priori into two phases. The first phase included three sampling times between the start and the 9 hours of incubation (3, 6 and 9 h) and the second phase was considered from that moment to the end of incubation (12, 16 and 24 h). Since in vitro accumulated gas production is measured over time on the same experimental unit, the methodology proposed by Gómez et al. (2019)Gómez, S., Torres, V., García, Y., Herrera, M., Medina, Y. & Rodríguez, R. 2019. "Statistical procedure for the analysis of experiments with repeated measures over time in the agricultural and livestock field". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(4): 353-360, ISSN: 2079-3480. was applied. For the analysis of these data, SAS (2013)Statistical Analysis Systems (SAS). 2013 The SAS System for Windows, Release 9.3. Statistical Analysis Systems Institute, Cary, North Carolina, USA. statistical package, version 9.3, was used.

The chemical composition of forages and sweet potato tuber used in silage production was previously reported (Rodríguez et al. 2020Rodríguez, R., Ontivero, Y., García, Y, Sosa, D. & Gómez, S. 2020. "Empleo del tubérculo de boniato (Ipomoea batatas L.) y la cepa Lactobacillus pentosus LB-31 como aditivos a ensilajes mixtos para rumiantes". Livestock Research for Rural Development, 32, ISSN: 0121-3784, Available: <http://www.lrrd.org/lrrd32/7/rodri32117.htmL>.). In all cases, forage DM values were higher than 30% as suggested by Michelena and Molina (1990)Michelena, J.B. & Molina, A. 1990. "The effect of time of sun exposure of King grass (hybrid Pennisetum) on silage quality". Cuban Journal of Agricultural Science, 24(2): 219-224, ISSN: 2079-3480..

When evaluating the effect of additives on DM yield, estimated as the proportion between obtained silage DM and the DM of materials to be conserved and expressed as percent, there was no interaction among factors nor effect of microbial additive LB-25 (P> 0.05). However, sweet potato inclusion level affected this indicator (P <0.05) by decreasing with 50% inclusion of the tuber (figure 1). In all the treatments, DM yield showed values ​​higher than 96.6%, which could be related to the high DM levels of the preserved forage mix and to the type of microsilo used in the study, which does not have losses due to lixiviation.

Regarding pH, there was no interaction between the effects of the two evaluated additives nor the effect of LB-25 microbial additive (P> 0.05). However, the inclusion of sweet potato influenced on this indicator of fermentation (P = 0.003) although no differences were observed between 25 and 50% of tubers (figure 2).

High pH values ​​observed in the treatments without sweet potato did not affect the organoleptic characteristics of microsilos nor were there signs of putrefaction or the presence of filamentous fungi. The maximum pH value for obtaining quality silage is between 3.8 and 4.2 (McDonald et al. 1991McDonald, P., Henderson, A.R. & Heron, S.J.E. 1991. Principle of Ensilage. In: The Biochemistry of Silage. 2nd Ed. McDonald, P., Henderson, A. R. & Heron, S.J.E. (eds). Ed. Chalcombe, Marlow, England, p. 9-40, ISBN: 978-0948617225.). However, other research has also found that, at high DM content of forage to be ensiled, good products preserved at higher pH can be obtained (Castle and Watson 1984 Castle, M.E. & Watson, J.N. 1984. "Silage and milk production: A comparison between unwilted and wilted grass silages". Grass and Forage Science, 39(2): 187-193, ISSN: 1365-2494, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2494.1984.tb01680.x. and Dumont 1994Dumont, J.C. 1994. Análisis y composición química de ensilajes. In: ΙΙ Seminario “Producción y utilización de ensilajes de pradera para agricultores de la zona sur”. González, M. & Bortolameolli, G. (eds.). Ed. Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Estación Experimental Remehue, Serie Remehue, nº 52, p: 27-37. ). In fact, it is argued that it is common to find silages with higher pH values ​​when they have been produced with pre-dried forages (dos Santos et al. 2013Dos Santos, R.J.C., Andrade, M., Guim, A., dos Santos, M.V.F., Batista, J.C. & de Leão de Mello, A.C. 2013. "Elephant grass clones for silage production". Scientia Agricola, 70(1): 6-11, ISSN: 1678-992X, DOI: https://doi.org/10.1590/S0103-90162013000100002.).

There was also no interaction of evaluated factors on indicators of chemical composition (P>0.05). After analyzing individual factors, it was observed that sweet potato level affected DM, OM, NDF and ADF (P <0.0001), while the inclusion of LB-25 strain increased NDF (P=0.048). None of the additives had an effect on CP content of evaluated silages (P> 0.05) and the values ​​obtained for this indicator were superior to 10.0% for all treatments.

Table 1 shows the effect of sweet potato inclusion level and the inclusion of LB-25 on indicators of chemical composition of the evaluated silages. DM and NDF contents decreased with the increase of tuber level because the pre-dried forage core was replaced by a fresh material with a lower content of DM and fiber (P <0.0001). However, OM content increased and ADF content decreased with the inclusion of 25% of the tuber (P <0.0001), but, in both cases, there was no difference between silages with 25 and 50% of this additive.

Even though differences in DM content were observed, all evaluated treatments showed DM superior to 30%, which is the minimum recommended value to obtain quality silages (Michelena and Molina 1990Michelena, J.B. & Molina, A. 1990. "The effect of time of sun exposure of King grass (hybrid Pennisetum) on silage quality". Cuban Journal of Agricultural Science, 24(2): 219-224, ISSN: 2079-3480.). The high levels obtained of NDF could be associated to cutting age of forages and the disappearance of soluble material during anaerobic fermentation (Rodríguez et al. 2016Rodríguez, R., Elías, A., Herrera, F., González, N., Moreira, O., Gutiérrez, D., Gómez, S., Sarduy, L. & Medina, Y. 2016. "Valor nutritivo de ensilajes mixtos Pennisetum purpureum (vc. CUBA CT-169): Moringa oleifera: Ipomoea batata, inoculados con el producto biológico VITAFERT". Available: <http://www.engormix.com/MA-ganaderia-carne/nutricion/articulos/cuba2015-valor-nutritivo-ensilajes-t39536/141-p0.htm>, [Consulted: April 25th, 2020]. and Rodríguez et al. 2019Rodríguez, R., Herrera, F., Gómez, S., González, N., Alonso, J., Elías, A., Moreira, O., Sarduy, L. & Medina, Y. 2019. "Effects of including sweet potato (Ipomoea batatas) and Vitafert as additives on the nutritional value of Cenchrus purpureus cv. CUBA CT-169 and Moringa oleifera silages". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 119-133, ISSN: 2079-3480.). On the other hand, increase of OM can be related to the higher OM content of sweet potato.

Due to the low protein content of sweet potato tubers, a decrease of CP content was expected with the increase of this additive in silage, as found by Neiva et al. (2001)Neiva, J.N.M., Ferreira, A.C.H. & Teixeira, M. 2001. Uso de caña de azúcar (Saccharum officinarum) deshidratada como aditivo en el ensilaje de pasto elefante (Pennisetum purpureum). Cartel Técnico 9.2. In: Uso del ensilaje en el trópico privilegiando opciones para pequeños campesinos. Memorias de la Conferencia Electrónica de la FAO sobre los Ensilajes Tropicales. ´tMannetje, L. (ed.). Ed. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. Rome, Italy, p. 175-176, ISBN: 92-5-304500-0 by increasing sugarcane levels as a source of soluble carbohydrates. However, the fact that there were no differences could be related to the availability of nonstructural carbohydrates provided by the tuber, that could favor nitrogen retention processes through microbial protein synthesis. In any case, CP values found were higher than the 6-8% PB suggested by Mertens (1994)Mertens, D.R. 1994. Regulation of forage intake. In: Forage quality, evaluation and utilization. Fahey Jr., G.C. (Ed.). American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, USA, p.450-493, ISBN: 9780891185796, DOI: https://doi.org/10.2134/1994.foragequality.c11 , as a minimum content so that this nutrient does not limit the fermentation of carbohydrates by the rumen microorganisms.

Regarding the effect of the inclusion of LB-25 microbial additive on NDF content, similar results were found by Junges et al. (2013)Junges, D., Schmidt, P., Ortiz, C. & Pratti, J.L. 2013. "Additive containing homo and heterolactic bacteria on the fermentation quality of maize silage". Acta Scientiarum. Animal Sciences, 35(4): 371-377, ISSN: 1806-2636, DOI: https://doi.org/10.4025/actascianimsci.v35i4.18833. when evaluating a mixture of L. plantarum, L. brevis and E. faecium as a microbial additive. These authors related this increase of NDF content by including microbial additives, with the fermentation of part of the soluble components of forage to be preserved by the inoculated bacteria, which leads to the proportional increase of insoluble components. However, Ozduven et al. (2017)Ozduven, M.L., Okuyucu, B., Büyükkiliç Beyzi, S. & Konca, Y. 2017. "The effects of lactic acid bacterial inoculants on the fermentation, aerobic stability and nutritive value of sunflower silages". International Journal of Current Research, 9(7): 54289-54295, ISSN: 0975-833X. , when inoculating with L. buchneri and P. acidilactici observed that these microorganisms improved the fermentation characteristics and decreased NDF and ADF content of silages of sunflower plants.

In vitro fermentation of silages.Table 2 shows the parameters of equations of the best fit to the experimental data obtained according to the exponential model of Krishnamoorthy et al. (1991)Krishnamoorthy, U., Soller, H., Steingass, H. & Menke, K.H. 1991. "A comparative study on rumen fermentation of energy supplements in vitro". Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 65(1-5): 28-35, ISSN: 1439-0396, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1439-0396.1991.tb00237.x., which was able to explain a high percent of the variability of data of accumulative in vitro gas production for all treatments (R2> 0.9783).

It was observed that gas production potential (parameter D) tended to increase with sweet potato inclusion level. The same trend was show by the microbial additive when used with forages alone and 50% of sweet potato. Regarding the fractional rate or parameter c, there was also a tendency to increase when including sweet potato, but, at the same inclusion level of the tuber, there were no differences in the magnitudes of this parameter when including the microbial additive or not. On the other hand, the Lag phase (parameter L) showed an inverse trend because with the inclusion of sweet potato, the time required to start fermentation tended to decrease, but, like for fractional rate, this indicator was not affected by the inclusion of Pediococcus strain.

The increase of potential and fractional rate of gas production when sweet potato was included could be due to the greater amount of soluble carbohydrates available for fermentation, which corroborates the increase of nutritional value of silages by including this energy additive. Similar responses were observed when replacing Cenchrus forage with better quality T. diversifolia forage (Morales et al. 2016Morales, A., Rodríguez, R., Gutiérrez, D., Elías, A., Gómez, S. & Sarduy, L. 2016. "Evaluación de la inclusión de VITAFERT en el valor nutritivo de ensilajes de Tithonia diversifolia y Pennisetum purpureum". Cuban Journal of Agricultural Science, 50(4): 619-630, ISSN: 2079-3480.) or including up to 15% of sweet potato in mixed silages of Cenchrus and M. oleifera (Rodríguez et al. 2019Rodríguez, R., Herrera, F., Gómez, S., González, N., Alonso, J., Elías, A., Moreira, O., Sarduy, L. & Medina, Y. 2019. "Effects of including sweet potato (Ipomoea batatas) and Vitafert as additives on the nutritional value of Cenchrus purpureus cv. CUBA CT-169 and Moringa oleifera silages". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 119-133, ISSN: 2079-3480.).

For the variable accumulative production of in vitro gas, there was no interaction between sweet potato level, the inclusion or not of LB-25 and sampling times, in the two phases of fermentation in which the sampling times were distributed a priori (P> 0.05).

Table 3 shows the individual effects of factors analyzed in the accumulated production of in vitro gas. It was appreciated that the effect of energy additive on accumulated gas production had the following performance in both fermentation phases: level 50%> level 25%> level 0% (P<0.0001). Similarly, it was observed that the microbial additive improved gas production in the second phase of fermentation (P=0.0470). Regarding the factor sampling time, in both phases, gas production increased over time (P <0.0001).

Indicators of in vitro fermentation of silages. At 24 hours, there was no interaction between tuber level and microbial additive inclusion, nor the effect of LB-25 inclusion in DAIVMS (P>0.05). However, sweet potato level influenced on this gravimetric indicator (figure 3). DAIVMS increased with 50% of tuber inclusion, but no differences were observed between the other two inclusion levels (P=0.0207).

The observed DAIVMS was higher than that reported by Rodríguez et al. (2019)Rodríguez, R., Herrera, F., Gómez, S., González, N., Alonso, J., Elías, A., Moreira, O., Sarduy, L. & Medina, Y. 2019. "Effects of including sweet potato (Ipomoea batatas) and Vitafert as additives on the nutritional value of Cenchrus purpureus cv. CUBA CT-169 and Moringa oleifera silages". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 119-133, ISSN: 2079-3480. for silages of C. purpureus (cv. Cuba CT-169) and M. oleifera, with the same cutting age and lower sweet potato inclusion levels (5, 10 and 15%). This confirms the importance of increasing inclusion levels of energy additives in mixed silages of tropical forages, to improve fermentation conditions for their conservation and their nutritional quality as feed for ruminants (Mühlbach 2001Müehlbach, P.R.F. 2001. Uso de aditivos para mejorar el ensilaje de los forrajes tropicales. Estudio FAO: Producción y Protección Vegetal. Available: <http://www.fao.org/3/X8486S/x8486s0b.htm>, [Consulted: April 22th, 2020]).

For N-NH3, there was also no interaction between sweet potato level and LB-25 inclusion, nor microbial additive effect (P> 0.05). However, sweet potato level influenced on this indicator (P<0.05), when an increase was observed after including 25 and 50% of tuber regarding silage with only forage (figure 4).

Results demonstrated higher ruminal concentrations of N-NH3 than those reported by Rodríguez et al. (2019)Rodríguez, R., Herrera, F., Gómez, S., González, N., Alonso, J., Elías, A., Moreira, O., Sarduy, L. & Medina, Y. 2019. "Effects of including sweet potato (Ipomoea batatas) and Vitafert as additives on the nutritional value of Cenchrus purpureus cv. CUBA CT-169 and Moringa oleifera silages". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 119-133, ISSN: 2079-3480.. These differences could be caused by the higher levels of moringa used and urea inclusion in the mixtures to be ensiled. In addition, ammonia N concentrations above 20 mg 100 mL were observed in all treatments, superior to ruminal values ​​considered optimal to maximize microbial protein synthesis (2-13 mg 100 mL-1) and ruminal fermentation rate of food (3-25 mg 100 mL-1) (Boucher et al. 2007Boucher, S.E., Ordway, R.S., Whitehouse, N.L., Lundy, F.P., Kononoff, P.J. & Schwab, C.G. 2007. "Effect of Incremental Urea Supplementation of a Conventional Corn Silage-Based Diet on Ruminal Ammonia Concentration and Synthesis of Microbial Protein". Journal of Dairy Science, 90: 5619-5633, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2007-0012.).

The lack of effects of microbial additive, except in the NDF content of silage and in the accumulated production of in vitro gas from 12 to 24 h, could be related to the preserved forage species. A meta-analysis of 130 articles showed that the effect of microbial additives varies according to the forage species (Oliveira et al. 2017Oliveira, A.S., Weinberg, Z.G., Ogunade, I.M., Cervantes, A.A.P., Arriola, K.G., Kim, Y.D., Li, X., Gonçalves, M.C.M., Vyas, D. & Adesogan, A.T. 2017. "Meta-analysis of effects of inoculation with homofermentative and facultative heterofermentative lactic acid bacteria on silage fermentation, aerobic stability, and the performance of dairy cows". Journal of Dairy Science, 100(6): 4587-4603, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2016-11815.). That study showed that the use of microbial additives, regardless of the conserved forage species, improved the production of lactic acid and reduced the concentrations of butyric acid and ammoniacal nitrogen in silage. However, inocula reduced pH in many temperate and tropical forages, including legumes, but it did not influence on this indicator when corn, sorghum and sugar cane were preserved. Similarly, they observed that it did not influence on yield of corn and sorghum silos, and this indicator worsened in sugar cane silages.

The inclusion of sweet potato tubers in mixed silages of C. purpureus x C. glaucum (OM-22 hybrid) and M. oleifera improved the nutritional value of conserved materials, with the best results with the inclusion of 50%. On the other hand, the use of P. pentosaceus LB-25 strain, at 5% (v/w), did not influence on nutritional quality of the evaluated silages, except NDF increased its content.

Obtención de los ensilajes Forrajes utilizados en la elaboración de los ensilajes. Las plantas se recolectaron en áreas experimentales del Instituto de Ciencia Animal (ICA) de Cuba. Se recolectaron por corte manual plantas de C. purpureus x C. glaucum (híbrido OM-22) y M. oleifera (moringa) de 90 y 60 días de edad, respectivamente; establecidas en suelo ferralítico rojo típico, de rápida desecación y perfil uniforme (Hernández et al. 2015Hernández, A., Pérez, J.M., Bosch, D. & Castro, N. 2015. Clasificación de los suelos de Cuba. Ed. INCA. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, p. 93, ISBN: 978-959-7023-77-7. ). Ambos forrajes se pasaron por un molino forrajero hasta alcanzar tamaño de partícula de 20-30 mm y el material molido se extendió para su presecado al sol en una superficie plana con escurrimiento hasta alcanzar MS superior al 30%.

Aditivos utilizados en la elaboración de los ensilajes. Como aditivo energético para incrementar el contenido de carbohidratos de fácil fermentación se empleó tubérculos de boniato. Se utilizaron boniatos de pequeño y mediano tamaño, sin lavar, pero sin tierra adherida. Los tubérculos se cortaron longitudinalmente en trozos y luego se redujo su tamaño lasqueándolos en láminas finas. Este proceso se realizó en el momento en que se prepararon los ensilajes para evitar en lo posible la oxidación de los almidones.

Como aditivo microbiano se utilizó el cultivo puro de la cepa de bacterias ácido-lácticas P. pentosaceus LB-25, obtenida del Banco de Microorganismos del ICA. Esta cepa se identificó por secuenciación del gen 16S ARN ribosomal y su secuencia se encuentra depositada en el GenBank (número de acceso: FR717465). La cepa se cultivó en caldo Rogosa (Oxoid, UK), a 37 ºC, durante 18 a 24 h. Después del período de incubación, se verificó su pureza y se garantizó concentraciones de 109 células·mL-1, determinadas por conteo en cámara de Neubauer.

Elaboración de los microsilos. La elaboración de los microsilos se realizó según la metodología propuesta por Rodríguez et al. (2016)Rodríguez, R., Elías, A., Herrera, F., González, N., Moreira, O., Gutiérrez, D., Gómez, S., Sarduy, L. & Medina, Y. 2016. "Valor nutritivo de ensilajes mixtos Pennisetum purpureum (vc. CUBA CT-169): Moringa oleifera: Ipomoea batata, inoculados con el producto biológico VITAFERT". Available: <http://www.engormix.com/MA-ganaderia-carne/nutricion/articulos/cuba2015-valor-nutritivo-ensilajes-t39536/141-p0.htm>, [Consulted: April 25th, 2020]. en tubos de vidrio (120 mm altura x 70 mm diámetro) herméticamente cerrados. Primero se preparó una mezcla con los forrajes a ensilar (OM-22 y moringa, 50:50 en base húmeda), que constituyó el núcleo fibroso y proteico de los ensilados a evaluar. Posteriormente se mezcló este núcleo con los tres niveles de tubérculos de boniato (0, 25 y 50%) y a continuación a todos los tratamientos se les asperjó uniformemente urea (1%) y sulfato de amonio (0.2%), diluidos en agua en una proporción (1:2), también en base húmeda. Terminado el mezclado con la urea y el sulfato de amonio, se dejó reposar 30 minutos antes de añadir el inóculo microbiano a los tratamientos. Para dicha inoculación, se asperjaron 75 mL de medio con el inóculo correspondiente por cada 1,5 kg del material a ensilar para cada combinación de forraje y boniato (5% v/p). A los tratamientos sin inóculo microbiano se le asperjó la misma cantidad de agua destilada para garantizar que todos los tratamientos se humedecieran homogéneamente.

Luego de un último mezclado, los tratamientos se introdujeron en los recipientes de vidrio, por capas que se compactaron con un pisón. Al finalizar, los recipientes se sellaron herméticamente. Los microsilos, con aproximadamente 300 g de materia fresca, se mantuvieron en condiciones de anaerobiosis por un período de 64 días. Los tratamientos evaluados fueron:

Al finalizar el proceso de ensilaje, se abrieron los microsilos y se tomó una muestra de 10 g de cada uno, se le añadió 90 mL de agua destilada y se mezcló en zaranda orbital a 250 rpm durante 15 minutos, a 20ºC. Luego la mezcla se filtró en gasa y al filtrado se le midió pH (pHmetro Everich, PHSJ-3F, China). Adicionalmente, se tomaron aproximadamente 200 g de cada microsilo, se secaron hasta peso constante en estufa de aire forzado, con temperatura regulada (60ºC) y luego se molieron en molino de martillo hasta alcanzar tamaño de partícula de 1 mm. Posteriormente, la mitad del material seco de cada microsilo se almacenó de manera individual en bolsas de nailon selladas para análisis de composición química. El resto del material seco se mezcló homogéneamente por tratamiento y el pool obtenido también se almacenó en bolsas de nailon selladas hasta su empleo en las evaluaciones in vitro.

Evaluación in vitro de la capacidad fermentativa de los ensilados obtenidos. Para evaluar el valor nutritivo de los ensilados mixtos obtenidos se realizaron dos ensayos in vitro, en los cuales se utilizó la técnica de producción de gas descrita por Theodorou et al. (1994)Theodorou, M.K., Williams, B., Dhanoa, M., McAllan, A.B. & France, J. 1994. "A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feeds". Animal Feed Science and Technology, 48(3-4): 185-197, ISSN: 0377-8401, DOI: https://doi.org/10.1016/0377-8401(94)90171-6.. Se incubó 1,0 g de cada tratamiento en botellas de vidrio de 100 mL, con medio de cultivo (Menke y Steingass 1988Menke, K.H. & Steingass, H. 1988. "Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid". Animal Research and Development, 28: 7-55, ISSN: 0340-3165.) e inóculo de microorganismos ruminales en proporción de 0,20 mL del volumen total de incubación (80 mL).

Se utilizó como inóculo el contenido ruminal de dos vacas de raza Siboney, adultas, estabuladas, alimentadas ad libitum con forraje de gramíneas y con libre acceso a agua y sales minerales. El contenido ruminal se recolectó a través de la cánula ruminal, antes de ofrecer el alimento en la mañana, y se conservó en termos cerrados independientes hasta llegar al laboratorio, donde se filtraron a través de gasa y se mezclaron en proporciones iguales. Durante el proceso, se mantuvo la temperatura de los inóculos a 39±1ºC, y condiciones anaeróbicas mediante flujo continuo de CO2. Las botellas se sellaron y se incubaron en baño, a temperatura controlada (39ºC). Se tomó ese momento como la hora cero de la incubación. En ambos ensayos se incubaron botellas sin sustrato como blancos.

En el primer ensayo, para determinar la cinética de fermentación in vitro de los ensilados obtenidos se midió la producción de gas hasta las 144 h, por medio de un manómetro HD8804 acoplado a un calibrador de presión TP804 (DELTA OHM, Italia). Después de cada medición, se liberó el gas hasta igualar las presiones externa e interna de las botellas. Se estimó el volumen de gas a partir de los datos de presión, mediante una ecuación de regresión lineal pre-establecida (Rodríguez et al. 2013Rodríguez, R., Lores, J., Gutiérrez, D., Ramírez, A., Gómez, S., Elías, A., Aldana, A.I., Moreira, O., Sarduy, L. & Jay, O. 2013. "Inclusion of the microbial additive Vitafert in the in vitro ruminal fermentation of a goat diet". Cuban Journal of Agricultural Science, 47(2): 171-178, ISSN: 2079-3480.). El volumen de gas se expresó por gramo de materia orgánica (MO) incubada (MOinc). Para estimar la cinética de producción de gas, se utilizó el modelo exponencial descrito por Krisnamoorthy et al. (1991)Krishnamoorthy, U., Soller, H., Steingass, H. & Menke, K.H. 1991. "A comparative study on rumen fermentation of energy supplements in vitro". Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 65(1-5): 28-35, ISSN: 1439-0396, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1439-0396.1991.tb00237.x.:

Donde, Y es la producción de gas acumulada (mL g-1 MOinc) a un tiempo de incubación t (h), D es el potencial de fermentación del sustrato en las condiciones de incubación (asíntota de la curva, mL g-1 MOinc), c es la tasa fraccional de fermentación (h-1) y L es la fase Lag de la fermentación (h).

En el segundo ensayo, la producción de gas se midió solo hasta las 24 horas de incubación (3, 6, 9, 12, 18 y 24 h). Al finalizar la incubación se abrieron las botellas y su contenido se filtró a través de bolsas de nailon (50 μm de porosidad y área superficial de 28 cm2), taradas previamente en balanza analítica (Sartorius BL 1500, ± 0,0001). Las bolsas con los residuos de la fermentación se secaron hasta peso constante en una estufa de aire forzado con temperatura regulada a 60ºC, durante 72 horas. Por este medio se determinó por gravimetría la degradabilidad aparente in vitro de la MS (DAIVMS) de los ensilajes evaluados, como la diferencia entre el sustrato incubado y el residuo de la fermentación, expresado como proporción del sustrato incubado y multiplicado por 100 (%).

Además, del filtrado se tomaron 5 mL de muestra para determinar el contenido de NH3, los que se preservaron y conservaron hasta el momento de su análisis.

Análisis químico. Para determinar la composición química de los ensilados, se les determinó MS, MO y proteína bruta (PB) (AOAC 2016AOAC (Association of Official Analytical Chemists). 2016. Official Methods of Analysis of AOAC International. 20th Ed. George W. Latimer Jr (ed). Ed. AOAC International, Rockville MD, USA, ISBN: 978-0935-584-875.). La fibra detergente neutro (FDN) y la fibra detergente ácido (FDA) se cuantificaron por el procedimiento descrito por Van Soest et al. (1991)Van Soest, P.J., Robertson, J.B. & Lewis, B.A. 1991. "Methods for Dietary Fiber, Neutral Detergent Fiber, and Nonstarch Polysaccharides in Relation to Animal Nutrition". Journal of Dairy Science, 74(10): 3583-3597, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(91)78551-2.. Para obtener la concentración de amoníaco en el ensayo in vitro, se utilizó la técnica colorimétrica propuesta por Chaney y Marbach (1962)Chaney, A.L. & Marbach, E.P. 1962. "Modified reagents for determination of urea and ammonia". Clinical Chemistry, 8(2): 130-132, ISSN: 0009-9147, DOI: https://doi.org/10.1093/clinchem/8.2.130. .

Análisis estadístico. Para el análisis de la composición química de los ensilajes evaluados, se empleó un diseño experimental completamente aleatorizado con arreglo factorial (3x2), donde los factores principales fueron los 3 niveles de inclusión de boniato (0, 25 y 50%) y la inclusión de aditivo microbiano (sin aditivo y con P. pentosaceus LB-25). Los microsilos se consideraron como unidad experimental (5).

En el ensayo in vitro de 24 h se empleó un diseño de bloques al azar con arreglo factorial (3x2), donde los factores analizados fueron los mismos que en el caso anterior y las incubaciones se consideraron como bloque (4). En este experimento las botellas se consideraron como unidad experimental (3 botellas por tratamiento).

En ambos casos, las variables se analizaron por ANOVA. Cuando se hallaron diferencias (P<0.05), las medias de los tratamientos se compararon por la dócima de rangos múltiple de Duncan (1955)Duncan, D.B. 1955. "Multiple Range and Multiple F Tests". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 0006-341X, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478.. Para estos análisis se empleó el paquete estadístico InfoStat (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. InfoStat. version 2012, [Windows], Universidad Nacional de Córdoba, Argentina: Grupo InfoStat. Available: http://www.infostat.com.ar ).

En el caso de la variable producción de gas acumulada in vitro se dividió a priori la fermentación en dos fases. La primera fase incluyó tres horarios de muestreo entre el inicio y las 9 horas de incubación (3, 6 y 9 h) y la segunda fase se consideró desde ese instante hasta el final de la incubación (12, 16 y 24 h). Como la producción acumulada de gas in vitro es medida repetida en el tiempo sobre la misma unidad experimental, se empleó la metodología propuesta por Gómez et al. (2019)Gómez, S., Torres, V., García, Y., Herrera, M., Medina, Y. & Rodríguez, R. 2019. "Statistical procedure for the analysis of experiments with repeated measures over time in the agricultural and livestock field". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(4): 353-360, ISSN: 2079-3480.. Para el análisis de estos datos se empleó el paquete estadístico SAS (2013)Statistical Analysis Systems (SAS). 2013 The SAS System for Windows, Release 9.3. Statistical Analysis Systems Institute, Cary, North Carolina, USA., versión 9.3.

La composición química de los forrajes y el tubérculo de boniato utilizados en la producción de los ensilajes se informó previamente (Rodríguez et al. 2020Rodríguez, R., Ontivero, Y., García, Y, Sosa, D. & Gómez, S. 2020. "Empleo del tubérculo de boniato (Ipomoea batatas L.) y la cepa Lactobacillus pentosus LB-31 como aditivos a ensilajes mixtos para rumiantes". Livestock Research for Rural Development, 32, ISSN: 0121-3784, Available: <http://www.lrrd.org/lrrd32/7/rodri32117.htmL>.). En todos los casos, los valores de MS de los forrajes fueron superiores al 30% según sugieren Michelena y Molina (1990)Michelena, J.B. & Molina, A. 1990. "The effect of time of sun exposure of King grass (hybrid Pennisetum) on silage quality". Cuban Journal of Agricultural Science, 24(2): 219-224, ISSN: 2079-3480..

Al evaluar el efecto de los aditivos en el rendimiento de MS, estimado como la proporción entre la MS de los ensilajes obtenidos y la MS de los materiales a conservar y expresado como por ciento, no se apreció interacción entre los factores ni efecto del aditivo microbiano LB-25 (P>0.05). Sin embargo, el nivel de inclusión de boniato sí afectó este indicador (P<0.05) al disminuir con el 50% de inclusión del tubérculo (figura 1). En todos los tratamientos el rendimiento de MS mostró valores superiores al 96.6%, lo cual pudo estar relacionado con los altos niveles de MS de la mezcla de forrajes conservada y al tipo de microsilo utilizado en el estudio, que no tiene pérdidas por lixiviación.

En cuanto al pH, no hubo interacción entre los efectos de los dos aditivos evaluados ni efecto del aditivo microbiano LB-25 (P>0.05). Sin embargo, la inclusión del boniato influyó en este indicador de la fermentación (P=0.003) aunque no se apreció diferencias entre 25 y 50% de tubérculos (figura 2).

Los valores elevados de pH observados en los tratamientos sin boniato no afectaron las características organolépticas de los microsilos ni se hallaron indicios de putrefacción o presencia de hongos filamentosos. El valor máximo de pH para obtener un ensilaje de calidad se plantea entre 3.8 y 4.2 (McDonald et al. 1991McDonald, P., Henderson, A.R. & Heron, S.J.E. 1991. Principle of Ensilage. In: The Biochemistry of Silage. 2nd Ed. McDonald, P., Henderson, A. R. & Heron, S.J.E. (eds). Ed. Chalcombe, Marlow, England, p. 9-40, ISBN: 978-0948617225.). Sin embargo, otras investigaciones también han observado que a altos contenidos de MS de los forrajes a ensilar se pueden obtener buenos productos conservados a pH más elevados (Castle y Watson 1984 Castle, M.E. & Watson, J.N. 1984. "Silage and milk production: A comparison between unwilted and wilted grass silages". Grass and Forage Science, 39(2): 187-193, ISSN: 1365-2494, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2494.1984.tb01680.x. y Dumont 1994Dumont, J.C. 1994. Análisis y composición química de ensilajes. In: ΙΙ Seminario “Producción y utilización de ensilajes de pradera para agricultores de la zona sur”. González, M. & Bortolameolli, G. (eds.). Ed. Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Estación Experimental Remehue, Serie Remehue, nº 52, p: 27-37. ). De hecho, se plantea que es común encontrar ensilajes con valores de pH más altos cuando se han confeccionado con forrajes presecados (dos Santos et al. 2013Dos Santos, R.J.C., Andrade, M., Guim, A., dos Santos, M.V.F., Batista, J.C. & de Leão de Mello, A.C. 2013. "Elephant grass clones for silage production". Scientia Agricola, 70(1): 6-11, ISSN: 1678-992X, DOI: https://doi.org/10.1590/S0103-90162013000100002.)

Tampoco hubo interacción de los factores evaluados en los indicadores de la composición química (P>0.05). Al analizar los factores individuales, se observó que el nivel de boniato incidió en MS, MO, FDN y FDA (P<0.0001), mientras que la inclusión de la cepa LB-25 incrementó la FDN (P=0.048). Ninguno de los aditivos tuvo efecto en el contenido de PB de los ensilajes evaluados (P>0.05) y los valores obtenidos para este indicador fueron superiores al 10.0% para todos los tratamientos.

En la tabla 1 se muestra el efecto del nivel de inclusión de boniato y de la inclusión de LB-25 en los indicadores de composición química de los ensilados evaluados. Los contenidos de MS y FDN disminuyeron al incrementar el nivel de tubérculo debido a que se sustituyó el núcleo de forrajes preseco por un material fresco con menor contenido de MS y fibra (P<0.0001). Sin embargo, el contenido de MO se incrementó y el de FDA disminuyó cuando se incluyó 25% del tubérculo (P<0.0001), pero en ambos casos no se apreció diferencia entre los ensilajes con 25 y 50% de este aditivo.

Aun cuando se apreciaron diferencias en el contenido de MS, todos los tratamientos evaluados mostraron MS superiores al 30% que es el valor mínimo recomendado para obtener ensilajes de calidad (Michelena y Molina 1990Michelena, J.B. & Molina, A. 1990. "The effect of time of sun exposure of King grass (hybrid Pennisetum) on silage quality". Cuban Journal of Agricultural Science, 24(2): 219-224, ISSN: 2079-3480.). Los altos tenores de FDN obtenidos podrían estar asociados a la edad de corte de los forrajes y a la desaparición de material soluble durante la fermentación anaeróbica (Rodríguez et al. 2016Rodríguez, R., Elías, A., Herrera, F., González, N., Moreira, O., Gutiérrez, D., Gómez, S., Sarduy, L. & Medina, Y. 2016. "Valor nutritivo de ensilajes mixtos Pennisetum purpureum (vc. CUBA CT-169): Moringa oleifera: Ipomoea batata, inoculados con el producto biológico VITAFERT". Available: <http://www.engormix.com/MA-ganaderia-carne/nutricion/articulos/cuba2015-valor-nutritivo-ensilajes-t39536/141-p0.htm>, [Consulted: April 25th, 2020]. y Rodríguez et al. 2019Rodríguez, R., Herrera, F., Gómez, S., González, N., Alonso, J., Elías, A., Moreira, O., Sarduy, L. & Medina, Y. 2019. "Effects of including sweet potato (Ipomoea batatas) and Vitafert as additives on the nutritional value of Cenchrus purpureus cv. CUBA CT-169 and Moringa oleifera silages". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 119-133, ISSN: 2079-3480.). Por su parte, el incremento en la MO se puede relacionar con el mayor contenido de MO del boniato.

Dado el bajo contenido proteico de los tubérculos de boniato, se esperaba una disminución del contenido de PB con el incremento de este aditivo en el ensilaje, tal como hallaron Neiva et al. (2001)Neiva, J.N.M., Ferreira, A.C.H. & Teixeira, M. 2001. Uso de caña de azúcar (Saccharum officinarum) deshidratada como aditivo en el ensilaje de pasto elefante (Pennisetum purpureum). Cartel Técnico 9.2. In: Uso del ensilaje en el trópico privilegiando opciones para pequeños campesinos. Memorias de la Conferencia Electrónica de la FAO sobre los Ensilajes Tropicales. ´tMannetje, L. (ed.). Ed. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. Rome, Italy, p. 175-176, ISBN: 92-5-304500-0 al aumentar los niveles de caña de azúcar como fuente de carbohidratos solubles. Sin embargo, el que no hubiera diferencias pudo estar asociado a que la disponibilidad de carbohidratos no estructurales aportados por el tubérculo pudo favorecer procesos de retención del nitrógeno a través de síntesis de proteína microbiana. En todo caso, los valores de PB encontrados fueron superiores a los 6-8% PB que sugirió Mertens (1994)Mertens, D.R. 1994. Regulation of forage intake. In: Forage quality, evaluation and utilization. Fahey Jr., G.C. (Ed.). American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, USA, p.450-493, ISBN: 9780891185796, DOI: https://doi.org/10.2134/1994.foragequality.c11 como contenido mínimo para que este nutriente no limite la fermentación de carbohidratos por los microorganismos del rumen.

Respecto al efecto de la inclusión del aditivo microbiano LB-25 en el contenido de FDN, resultados similares encontraron Junges et al. (2013)Junges, D., Schmidt, P., Ortiz, C. & Pratti, J.L. 2013. "Additive containing homo and heterolactic bacteria on the fermentation quality of maize silage". Acta Scientiarum. Animal Sciences, 35(4): 371-377, ISSN: 1806-2636, DOI: https://doi.org/10.4025/actascianimsci.v35i4.18833. al evaluar como aditivo microbiano una mezcla de L. plantarum, L. brevis y E. faecium. Estos autores relacionaron este incremento del contenido de FDN al incluir aditivos microbianos, con la fermentación de parte de los componentes solubles del forraje a conservar por las bacterias inoculadas, lo que conlleva al aumento proporcional de los componentes insolubles. Sin embargo, Ozduven et al. (2017)Ozduven, M.L., Okuyucu, B., Büyükkiliç Beyzi, S. & Konca, Y. 2017. "The effects of lactic acid bacterial inoculants on the fermentation, aerobic stability and nutritive value of sunflower silages". International Journal of Current Research, 9(7): 54289-54295, ISSN: 0975-833X. al inocular con L. buchneri y P. acidilactici observaron que estos microorganismos mejoraban las características de la fermentación y disminuían el contenido de FDN y FDA de ensilajes de plantas de girasol.

Fermentación in vitro de los ensilados. En la tabla 2 se muestran los parámetros de las ecuaciones de mejor ajuste a los datos experimentales obtenidos según el modelo de exponencial de Krishnamoorthy et al. (1991)Krishnamoorthy, U., Soller, H., Steingass, H. & Menke, K.H. 1991. "A comparative study on rumen fermentation of energy supplements in vitro". Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 65(1-5): 28-35, ISSN: 1439-0396, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1439-0396.1991.tb00237.x., que fue capaz de explicar alto por ciento de la variabilidad de los datos de producción acumulada de gas in vitro de todos los tratamientos (R2 > 0.9783).

Se pudo apreciar que el potencial de producción de gas (parámetro D) tendió a incrementarse con el nivel de inclusión de boniato. Igual tendencia se apreció para el aditivo microbiano cuando se empleó con los forrajes solo y 50% de boniato. Respecto a la tasa fraccional o parámetro c, también se apreció una tendencia a incrementarse al incluir boniato, pero a igual nivel de inclusión del tubérculo no se observó diferencias en las magnitudes de este parámetro al incluir o no el aditivo microbiano. Por su parte, la fase Lag (parámetro L) mostró una tendencia inversa pues al incluir boniato el tiempo requerido para comenzar la fermentación tendió a disminuir, pero al igual que para la tasa fraccional este indicador no se afectó con la inclusión de la cepa de Pediococcus.

El incremento del potencial y la tasa fraccional de producción de gas cuando se incluyó boniato pudo estar dado por la mayor cantidad de carbohidratos solubles disponibles para la fermentación, lo que corrobora el incremento del valor nutritivo de los ensilados al incluir este aditivo energético. Respuestas similares se observaron al sustituir forraje de Cenchrus por forraje de T. diversifolia de mejor calidad (Morales et al. 2016Morales, A., Rodríguez, R., Gutiérrez, D., Elías, A., Gómez, S. & Sarduy, L. 2016. "Evaluación de la inclusión de VITAFERT en el valor nutritivo de ensilajes de Tithonia diversifolia y Pennisetum purpureum". Cuban Journal of Agricultural Science, 50(4): 619-630, ISSN: 2079-3480.) o incluir hasta 15% de boniato en ensilajes mixtos de Cenchrus y M. oleifera (Rodríguez et al. 2019Rodríguez, R., Herrera, F., Gómez, S., González, N., Alonso, J., Elías, A., Moreira, O., Sarduy, L. & Medina, Y. 2019. "Effects of including sweet potato (Ipomoea batatas) and Vitafert as additives on the nutritional value of Cenchrus purpureus cv. CUBA CT-169 and Moringa oleifera silages". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 119-133, ISSN: 2079-3480.).

Para la variable producción acumulada de gas in vitro, no hubo interacción entre el nivel de boniato, la inclusión o no de LB-25 y los horarios de muestreo, en las dos fases de la fermentación en que a priori se distribuyeron los horarios de muestreo (P> 0.05).

En la tabla 3 se muestran los efectos individuales de los factores analizados en la producción acumulada de gas in vitro. Se apreció que el efecto del aditivo energético en la producción acumulada de gas tuvo en ambas fases de la fermentación el siguiente comportamiento: nivel 50%> nivel 25%> nivel 0% (P<0,0001). De igual forma, se observó que el aditivo microbiano mejoró la producción de gas en la segunda fase de la fermentación (P=0.0470). Respecto al factor horario de muestreo, en ambas fases la producción de gas se incrementó en el transcurso del tiempo (P<0,0001).

Indicadores de la fermentación in vitro de los ensilados. A las 24 horas no hubo interacción entre el nivel de tubérculo y la inclusión del aditivo microbiano, ni efecto de la inclusión del LB-25 en la DAIVMS (P>0.05). Sin embargo, el nivel de boniato sí influyó en este indicador gravimétrico (figura 3). La DAIVMS se incrementó con el 50% de inclusión del tubérculo, pero no se apreció diferencias entre los otros dos niveles de inclusión (P=0.0207).

La DAIVMS observada fue superior a la reportada por Rodríguez et al. (2019Rodríguez, R., Herrera, F., Gómez, S., González, N., Alonso, J., Elías, A., Moreira, O., Sarduy, L. & Medina, Y. 2019. "Effects of including sweet potato (Ipomoea batatas) and Vitafert as additives on the nutritional value of Cenchrus purpureus cv. CUBA CT-169 and Moringa oleifera silages". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 119-133, ISSN: 2079-3480.) para ensilados de C. purpureus (vc. Cuba CT-169) y M. oleifera, con la misma edad de corte y la inclusión de niveles inferiores de boniato (5, 10 y 15%). Esto reafirma la importancia de incrementar los niveles de inclusión de aditivos energéticos en ensilajes mixtos de forrajes tropicales, para mejorar tanto las condiciones de fermentación para su conservación como su calidad nutritiva como alimento para rumiantes (Mühlbach 2001Müehlbach, P.R.F. 2001. Uso de aditivos para mejorar el ensilaje de los forrajes tropicales. Estudio FAO: Producción y Protección Vegetal. Available: <http://www.fao.org/3/X8486S/x8486s0b.htm>, [Consulted: April 22th, 2020]).

Para el N-NH3 tampoco hubo interacción entre el nivel de boniato y la inclusión de LB-25, ni efecto del aditivo microbiano (P>0.05). Sin embargo, el nivel de boniato influyó en este indicador (P<0.05), al observarse un incremento al incluir 25 y 50% del tubérculo en relación con el ensilaje con solo forrajes (Figura 4).

Los resultados obtenidos mostraron mayores concentraciones ruminales de N-NH3 que los informados por Rodríguez et al. (2019)Rodríguez, R., Herrera, F., Gómez, S., González, N., Alonso, J., Elías, A., Moreira, O., Sarduy, L. & Medina, Y. 2019. "Effects of including sweet potato (Ipomoea batatas) and Vitafert as additives on the nutritional value of Cenchrus purpureus cv. CUBA CT-169 and Moringa oleifera silages". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 119-133, ISSN: 2079-3480.. Estas diferencias pudieron estar dadas por los mayores niveles de moringa utilizados y por la inclusión de urea en las mezclas a ensilar. Además, en todos los tratamientos se observaron concentraciones de N amoniacal por encima de los 20 mg 100 mL, superiores a los valores ruminales considerados óptimos para maximizar la síntesis de proteína microbiana (2 - 13 mg 100 mL-1) y la tasa de fermentación ruminal de los alimentos (3 - 25 mg 100 mL-1) (Boucher et al. 2007Boucher, S.E., Ordway, R.S., Whitehouse, N.L., Lundy, F.P., Kononoff, P.J. & Schwab, C.G. 2007. "Effect of Incremental Urea Supplementation of a Conventional Corn Silage-Based Diet on Ruminal Ammonia Concentration and Synthesis of Microbial Protein". Journal of Dairy Science, 90: 5619-5633, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2007-0012.).

La falta de efectos del aditivo microbiano, excepto en el contenido de FDN del ensilaje y en la producción acumulada de gas in vitro desde las 12 a las 24 h, pudo estar relacionado con las especies forrajeras conservadas. Un meta-análisis de 130 artículos mostró que el efecto de los aditivos microbianos varía según la especie de forraje (Oliveira et al. 2017Oliveira, A.S., Weinberg, Z.G., Ogunade, I.M., Cervantes, A.A.P., Arriola, K.G., Kim, Y.D., Li, X., Gonçalves, M.C.M., Vyas, D. & Adesogan, A.T. 2017. "Meta-analysis of effects of inoculation with homofermentative and facultative heterofermentative lactic acid bacteria on silage fermentation, aerobic stability, and the performance of dairy cows". Journal of Dairy Science, 100(6): 4587-4603, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2016-11815.). Ese estudio demostró que el uso de aditivos microbianos, independientemente de la especie forrajera conservada, mejoraba la producción de ácido láctico y reducía las concentraciones de ácido butírico y nitrógeno amoniacal en el ensilaje. Sin embargo, los inóculos reducían el pH en muchos forrajes templados y tropicales, incluso leguminosas, pero no influía en este indicador cuando se conservaba maíz, sorgo y caña de azúcar. De igual manera, observaron que no influía en el rendimiento de silos de maíz y sorgo, y este indicador empeoraba en ensilajes de caña de azúcar.

La inclusión de tubérculos de boniato en ensilajes mixtos de C. purpureus x C. glaucum (híbrido OM-22) y M. oleifera mejoró el valor nutritivo de los materiales conservados, con los mejores resultados cuando se incluyó al 50%. Por su parte, el empleo de la cepa P. pentosaceus LB-25, al 5% (v/p), no influyó en la calidad nutritiva de los ensilajes evaluados, excepto que aumentó el contenido de FDN.