Preparation of PROBIOLACTIL® and SUBTILPROBIO® zootechnical additives. From the Lactobacillus salivarius C-65 and Bacillus subtilis C-31 strains respectively, 20 L of each bioproduct were produced. For the preparation of additives, the methodology described by Rondón (2009)Rondón, A.J. 2009. Obtención de biopreparados a partir de lactobacilos autóctonos del tracto digestivo de pollos y evaluación integral de las respuestas de tipo probióticas provocadas en estos animales. PhD Thesis. Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, p. 100. and Milián et al. (2017)Milián, G., Rondón, A.J., Pérez, M., Arteaga, F., Bocourt, R., Portilla, Y., Rodríguez, M., Pérez, Y., Beruvides, A. & Laurencio, M. 2017. "Methodology for the isolation, identification and selection of Bacillus spp. strains for the preparation of animal additives". Cuban Journal of Agricultural Science, 51(2): 197-207, ISSN: 2079-3480. was followed.

Treatments and experimental conditions. The experiment was carried out in the Unidad Porcina Gelpis, in Matanzas province. An amount of 200 crossbred pigs was used, weaned at 33 d, from York-Land (YL), Large White-Landrace (LWxL), and Duroc Jersey and L-3534 sires, from 34 to 76 d (42 d). The study took place from November 19 to December 30, 2018. During this period, a mean temperature of 26 ºC ± 2, minimum of 20 ºC ± 3 and maximum of 27 ºC ± 1 was recorded. The mean relative humidity was 79% ± 3. A completely randomized design was applied, in which four treatments were included, 50 animals each: 1 control) basal diet without additives, 2) basal diet + PROBIOLACTlL® additive (10 mL/animal/d), 3) basal diet + SUBTILPROBIO® additive (10 mL / animal / d) and 4) basal diet + mixture of PROBIOLACTlL® + SUBTILPROBIO® additives (5mL/animal/d of each biopreparation).

Doses of additives was adjusted to 109 CFU.mL-1, which were mixed with water for homogenization. Samplings were carried out at 34, 45, 60 and 76 d.

Feeding and management conditions. Table 1 shows the composition of the provided diet. Food was provided in the form of corn-soy-based meal, according to NRC (2012)NRC (National Research Council). 2012. Nutrients Requirements of Pigs. 10th Ed. Ed. National Academy Press, Washington D.C., USA, p. 96, DOI: https://doi.org/10.17226/6016..

Facilities, in which pigs were housed (Flat Decks system), underwent a sanitary authorization, as established for these animals (IIP 2008Instituto de Investigaciones Porcinas. 2008. Manual de procedimientos técnicos para la crianza porcina. Grupo de Producción Porcina, Ministerio de la Agricultura, La Habana, p. 84.). Ten pigs were located per pen, for a total of 20 pens. Water was provided ad libitum and food intake was restricted according to consumption regulations established for this category (GRUPOR 2017GRUPOR. 2017. Boletín Anual de indicadores productivos en la producción porcina en Cuba. Ministerio de la Agricultura, La Habana, Cuba.).

Determination of the effect of biopreparations and the mixture on microbiological, productive and health indicators. For determining microbiological indicators, samples of fecal content (1 g) were taken from 10 piglets per treatment at 34, 45, 60 and 76 d. They were homogenized in 9 mL of diluent medium (Caldwell and Bryant 1966Caldwell, D.R. & Bryant, M.P. 1966. "Medium without fluid for non-selective enumeration and isolation of rumen bacteria". Applied and Environmental Microbiology, 14(5): 794-801, ISSN: 1098-5336. ) and immediately processed under anaerobic conditions (5% CO2 atmosphere). To perform the count of lactic acid bacteria (LAB) and coliforms, serial dilutions of samples (1:10, w/v) were carried out in a diluent medium until 10-11. Out of these dilutions, 10-9, 10-10 and 10-11 were used for LAB, and 10-6,10-7 and 10-8 for coliforms. Each was replicated three times (0.5 mL) on plates containing selective culture medium. For coliforms, violet red bile agar (OXOID) was used, and, for LAB, MRS agar (CONDO, Spain). After incubating at 37 ºC (for 72 h for LAB and 24 h for coliforms), microbial count was performed. The CFU number was determined under magnifying glass by visual colony count. In productive and health indicators, live weight of pigs was evaluated every week and daily mean gain (DMG), food conversion (FC) and weight gain (WG) were calculated. The incidence of diarrhea and mortality in animals was also observed every day.

Statistical processing. For data analysis, the statistical program INFOSTAT, version 2012 (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. InfoStat version 2012 [Windows]. Grupo InfoStat, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Available: http://www.infostat.com.ar ) was used. For productive variables, a one-way analysis of variance model was applied, after checking the normal distribution of data and the variance homogeneity using Shapiro and Wilk (1965)Shapiro, S. & Wilk, B. 1965. "An análisis of variante test for normalita (complete simples)". Biometrika, 52(3-4): 591-611, ISSN: 1464-3510, DOI: https://doi.org/10.1093/biomet/52.3-4.591. and Levene (1960)Levene, H. 1960. Robust tests for the equality of variance. Contributions to Probability and Statistics. 1st Ed. Ed. Stanford University Press, Palo Alto, California, USA, p. 278-292. tests, respectively. Microbial counts were transformed to LN and subsequently to √X, and normality was checked again. Differences between groups were verified using Duncan (1955)Duncan, D.B. 1955. "Multiple range and multiple F test". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 0006-341X, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478. multiple range comparison test. Results of diarrhea incidence were analyzed using ComparPro version 1 program (Font et al. 2007Font, H., Noda, A., Torres, V., Herrera, M., Lizazo, D., Sarduy, L. & Rodríguez, L. 2007. Paquete estadístico ComparPro versión 1. Departamento de Biomatemática, Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.).

Figure 1 shows the effect of PROBIOLACTIL®, SUBTILPROBIO® and its mixture, on the performance of coliform and LAB populations in feces of growing pigs. At 34 d, there were no differences in the count of these microbial groups in the different treatments. However, after 45, there was an increase (P <0.05) of LAB and a decrease of coliforms in the groups in which biopreparations were applied, with respect to control. Furthermore, it was found that, out of the additives used, PROBIOLACTIL® was the one that caused the greatest increase (P <0.05) of LAB population.

The addition of this biopreparation, containing Lactobacillus salivarius, should have increased LAB population in the GIT, which are part of the native microbiota of this ecosystem. According to Pieper et al. (2006)Pieper, R., Janczyk, P., Schumann, R. & Souffrant, W.B. 2006. "The intestinal microflora of piglets around weaning-with emphasis on lactobacilli". Archiva Zootechnica, 9: 28-40, ISSN: 2344-4592., Lactobacillus salivarius, L. fermentum and L. acidophilus species are the most abundant lactobacilli of the microbial community that inhabits the pig ileum during weaning period.

These results indicate that the application of the additive PROBIOLACTIL® in the established dose caused the colonization of the gastrointestinal tract of the pigs under study. Many probiotics, especially lactic acid bacteria, ferment carbohydrates to produce short-chain fatty acids, such as lactic acid and acetic acid, which lowers luminal pH to levels in which potentially pathogenic bacteria do not develop (Segura and de Bloss 2000Segura, A. & De Bloss, M. 2000. La alternativa a los promotores del crecimiento. Memorias III Congreso Nacional de Avicultura. Centro de Convenciones Plaza América, Varadero, Cuba, p. 37-44.).

It is also known that these bacteria produce bacteriocins and hydrogen peroxide (Price and Lee 1970Price, R.J. & Lee, J.S. 1970. "Inhibition of Pseudomonas species by hydrogen peroxide producing lactobacilli". Journal of Milk and Food Technology, 33(1): 13-18, ISSN: 0022-2747, DOI: https://doi.org/10.4315/0022-2747-33.1.13. and Nazef et al. 2008Nazef, L., Belguesmia, Y., Tani, A., Prévost, H. & Drider, D. 2008. "Identification of lactic acid bacteria from poultry feces: evidence on anti-Campylobacter and anti-Listeria activities". Poultry Science, 87(2): 329-334, ISSN: 1525-3171, DOI: https://doi.org/10.3382/ps.2007-00282.). These substances generally destroy the integrity of the cytoplasmic membrane by forming transmembrane pores, causing the release of amino acids and ATP. Therefore, the electrochemical gradient is not generated nor the proton-motive force is reached, necessary for ATP synthesis (Bajagai et al. 2016Bajagai, Y.S., Klieve, A.V., Dart, P.J. & Bryden, W.L. 2016. Probiotics in animal nutrition - Production, impact and regulation. Makkar, H.P.S (ed.). FAO Animal Production and Health Paper No. 179, Rome, Italy, ISBN: 978-92-5-109333-7. ).

Rondón et al. (2012)Rondón, A.J., Milián, G., Arteaga, F.G., Bocourt, R., Ranilla, M.J., Riaño, J., Samaniego, L.M., Rodríguez, Z., Pérez, M. & Rodríguez, M. 2012. "Identification and antimicrobial activity of Lactobacillus strains of poultry origin". Cuban Journal of Agricultural Science, 46(4): 403-409, ISSN: 2079-3480. determined in vitro that Lactobacillus salivarius C-65 species inhibited Escherichia coli 0157: H7 from the production of acids and bacteriocins. It is known that L. salivarius is a very prolific microorganism in the intestine, making it capable of competing with many others, including some pathogenic bacteria (Riboulet-Bisson et al. 2012Riboulet-Bisson, E., Sturme, M., Jeffery, I., O'Donnell, M., Neville, B., Forde, B., Claesson, M.; Harris, H., Gardiner, G., Casey, P., Lawlor, P., O'Toole, P. & Ross, R. 2012. "Effect of Lactobacillus salivarius bacteriocin Abp118 on the mouse and pig intestinal microbiota". PLoS One, 7(2): e31113, ISSN: 1932-6203, DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0031113.). Among them, L. salivarius is characterized by being a very effective probiotic bacteria, since it performs an essential function in maintaining a healthy digestive system.

Figure 2 shows the performance of live weight in the evaluated animals, with the use of PROBIOLACTIL®, SUBTILPROBIO® and its mixture during pre-fattening. An increase of live weight (P <0.05) was observed in pigs treated with the biopreparations with respect to control group. This increase was observed after 11 d of application, which corresponds to 45 d of birth. Regarding control, it was found that from that age, up to 76 d, weight gain occurred in all the treatments in which biopreparations were applied. However, the best results were achieved with the administration of PROBIOLACTIL®, followed by SUBTILPROBIO® and their mixture.

The best results were obtained in pigs treated with PROBIOLACTIL®. This biopreparation contains Lactobacillus salivarius C-65, a microorganism found in the digestive tract of different animals of zootechnical interest.

Iñiguez-Palomares et al. (2007)Iñiguez-Palomares, C. 2007. Identificación de interacciones tipo adhesina-carbohidrato en la adherencia de Lactobacillus probióticos a la mucosa intestinal de lechones. PhD Thesis. Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C., Hermosillo, Sonora, México. Available: <https://ciad.repositorioinstitucional.mx/jspui/>, [Consulted: December 2nd, 2019]. isolated eight strains of Lactobacillus, with probiotic potential, from the GIT of pigs due to their resistance to gastrointestinal transit barriers, to the property of adhering to the intestinal mucosa and to antibacterial activity against pathogenic microorganisms. However, L. salivarius was the species that fulfilled all the criteria to be selected as a probiotic.

The results of this study are in correspondence with criteria of authors who state that, with the use of zootechnical additives, apparent retention of nutrients included in the diet is increased (amount of consumed nutrients minus the amount of excreted nutrients) and the N, P and Ca (Ángel et al. 2005Ángel, R., Dalloul, R.A. & Doerr, J. 2005. "Metabolism and nutrition: Performance of broiler chickens fed diets supplemented with a direct-fed microbial". Poultry Science, 84(8):1222-1231, ISSN: 1525-3171, DOI: https://doi.org/10.1093/ps/84.8.1222.) retention is favored. Lactobacillus supplementation increases the activity of digestive enzymes, such as β-galactosidase, which stimulates gastrointestinal peristalsis and promotes nutrient digestibility (Zhao and Kim 2015Zhao, P.Y. & Kim, I.H. 2015. "Effect of direct-fed microbial on growth performance, nutrient digestibility, fecal noxious gas emission, fecal microbial flora and diarrhea score in weanling pigs". Animal Feed Science and Technology, 200: 86-92, ISSN: 0377-8401, DOI: https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2014.12.010.).

Table 2 shows the performance of productive indicators in pigs that consumed the different biopreparations.

These results are similar to those observed by Dowarah et al. (2018)Dowarah, R., Verma, A.K., Agarwal, N., Singh, P. & Singh, B.R. 2018. "Selection and characterization of probiotic lactic acid bacteria and its impact on growth, nutrient digestibility, health and antioxidant status in weaned piglets". PloS One, 13(3): e0192978, ISSN: 1932-6203, DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192978., who described that probiotic supplementation to growing pigs improved DMG and FC during 180 d. These criteria demonstrate that these microorganisms improve the use of nutrients contained in the diet.

Table 3 shows results of diarrhea incidence during the experiment. These may be associated with different action mechanisms proposed for probiotics, including normalization of altered microbial population, improvement of the intestinal immune barrier, particularly through secretory IgA response, and decrease of intestinal inflammatory responses. (Zhang et al. 2011Zhang, J., Deng, J., Wang, Z., Che, C., Li, Y. & Yang, Q. 2011. "Modulatory effects of Lactobacillus salivarius on intestinal mucosal immunity of piglets". Current Microbiology, 62: 1623-1631, ISSN: 1432-0991, DOI: https://doi.org/10.1007/s00284-011-9906-4., Khare et al. 2018Khare, A., Thorat, G., Bhimte, A. & Yadav, V. 2018. "Mechanism of action of prebiotic and probiotic". Journal of Entomology and Zoology Studies, 6(4): 51-53, ISSN: 2320-7078. and Plaza et al. 2019Plaza, J., Ruiz-Ojeda, F.J., Gil-Campos, M. & Gil, A. 2019. "Mechanisms of action of probiotics". Advances in Nutrition, 10(1): 49-66, ISSN: 2156-5376, DOI: https://doi.org/10.1093/advances/nmy063.).

The incidence of diarrhea showed lower values ​​in the animals that consumed the additives, a result that coincides with studies of Lu et al. (2018)Lu, X., Zhang, M., Zhao, L., Ge, K., Wang, Z., Jun, L. & Ren, F. 2018. "Growth performance and post-weaning diarrhea in piglets fed a diet supplemented with probiotic complexes". Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(11): 1791-1799, ISSN: 1738-8872, DOI: https://doi.org/10.4014/jmb.1807.07026., who referred to the reduction of mortality and the presence of animals with diarrhea when probiotics are applied. Kim et al. (2018)Kim, J., Kim, J., Kim, Y., Oh, S., Song, M., Hwan, J., Whang, K., Hyun, K. & Oh, S. 2018. "Influences of quorum‐quenching probiotic bacteria on the gut microbial community and immune function in weaning pigs". Animal Science Journal, 89(2): 412-422, ISSN: 1740-0929, DOI: https://doi.org/10.1111/asj.12954. studied the dynamics of intestinal microbial diversity during pig weaning, after providing food supplemented with probiotic bacteria. The bioassay results indicated that, in the presence of Lactobacillus acidophilus 30SC, the activity of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157: H7 was inhibited, while lactobacilli population increased in weaned pigs.

Other researchers, such as Deng et al. (2013)Deng, J., Li, Y., Zhang, J. & Yang, Q. 2013. "Co-administration of Bacillus subtilis RJGP16 and Lactobacillus salivarius B1 strongly enhances the intestinal mucosal immunity of piglets". Research in Veterinary Science, 94(1): 62-68, ISSN: 0034-5288, DOI: https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2012.07.025., also applied a mixture of Bacillus RJGP16 and Lactobacillus salivarius B1 to assess its effect on the stimulation of the immune system of pigs. These authors observed an increase of the production of interleukin (IL)-6 and porcine beta-defensins (pBD)-2 in the duodenum and ileum (P <0.01). They also confirmed an increase in the number of immunoglobulin (Ig) A (P <0.01) in the intestinal lumen. All these actions contribute to the reduction of potentially pathogenic microorganisms, which cause the presence of diarrhea.

Regarding these results, it is stated that probiotic microorganisms create a complex with animal own bacteria to favor defense mechanisms, production of antimicrobial substances, intestinal pH decrease, bacterial antagonism and stimulation of the activity of macrophages and lymphocytes, which influence on better productive yields (Bajagai et al. 2016Bajagai, Y.S., Klieve, A.V., Dart, P.J. & Bryden, W.L. 2016. Probiotics in animal nutrition - Production, impact and regulation. Makkar, H.P.S (ed.). FAO Animal Production and Health Paper No. 179, Rome, Italy, ISBN: 978-92-5-109333-7. and Markowiak and Śliżewska 2018Markowiak, P. & Śliżewska, K. 2018. "The role of probiotics, prebiotics and synbiotics in animal nutrition". Gut Pathogens, 10, 21, ISSN: 1757-4749, DOI: https://doi.org/10.1186/s13099-018-0250-0.).

Results similar to those of this study were obtained by Dowarah et al. (2017)Dowarah, R., Verma, A.K. & Agarwal, N. 2017. "The use of Lactobacillus as an alternative of antibiotic growth promoters in pigs: A review". Animal Nutrition, 3(1): 1-6, ISSN: 2405-6545, DOI: https://doi.org/10.1016/j.aninu.2016.11.002., who evaluated the efficacy of two probiotics (Lactobacillus acidophilus NCDC-15 and Pediococcus acidilactici FT28) in weight gain, diarrhea incidence, intestinal microbiota composition and pig health. These authors concluded that supplementation of these additives in basal diet improved growth performance, fecal microbial count and intestinal morphology in pigs. In addition, they considered that P. acidilactici FT28 strain was more effective in reducing diarrheas and maintaining the acidic environment of the digestive tract, indicating a synergic probiotic effect between these bacteria and the intestinal microbiota to promote animal health.

These results may be given because lactobacilli, unlike Bacillus, have the ability to colonize and adhere to intestinal mucosa, thus inhibiting potentially pathogenic microorganisms. They produce organic acids and maintain the integrity of epithelial cells. In addition, they can multiply under anaerobic conditions and remain viable for 28 d, after stopping treatment. They also activate the immune system and improve host health (Blajman et al. 2015Blajman, J., Gaziano, C., Zbruna, M.C., Soto, L., Astesana, D., Berisvil, A., Romero, A., Signorini, M. & Frizzo, L. 2015. "In vitro and in vivo screening of native lactic acid bacteria toward their selection as a probiotic in broiler chickens". Research in Veterinary Science, 101: 50-56, ISSN: 0034-5288, DOI: https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2015.05.017., Pluske et al. 2018Pluske, J.R., Kim, J.C. & Black, J.L. 2018. "Manipulating the immune system for pigs to optimise performance". Animal Production Science, 58(4): 666-680, ISSN: 1836-5787, DOI: https://doi.org/10.1071/AN17598. and Hernández et al. 2019Hernández-García, J.E., Frizzo, L., Rodríguez-Fernández, J.C., Valdez-Paneca, G., Virginia-Zbrun, M., & Calero-Herrera, I. 2019. "Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77". Revista de Salud Animal, 41(1): 1-13, ISSN: 2224-4700. ). Regarding the results of the mixture, it is evident the need to evaluate higher doses than those established for each additive, in order to analyze its effect on animals.

Results confirm the probiotic potential of these biopreparations, when applied to pigs during their growth stage, with better effects on those who consumed PROBIOLACTIL, a probiotic made up of Lactobacillus salivarius.

Elaboración de los aditivos zootécnicos PROBIOLACTIL® y SUBTILPROBIO®. A partir de las cepas Lactobacillus salivarius C-65 y Bacillus subtilis C-31, respectivamente, se produjeron 20 L de cada bioproducto. Para la elaboración de los aditivos se siguió la metodología descrita por Rondón (2009)Rondón, A.J. 2009. Obtención de biopreparados a partir de lactobacilos autóctonos del tracto digestivo de pollos y evaluación integral de las respuestas de tipo probióticas provocadas en estos animales. PhD Thesis. Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, p. 100. y Milián et al. (2017)Milián, G., Rondón, A.J., Pérez, M., Arteaga, F., Bocourt, R., Portilla, Y., Rodríguez, M., Pérez, Y., Beruvides, A. & Laurencio, M. 2017. "Methodology for the isolation, identification and selection of Bacillus spp. strains for the preparation of animal additives". Cuban Journal of Agricultural Science, 51(2): 197-207, ISSN: 2079-3480..

Tratamientos y condiciones experimentales. El experimento se realizó en la Unidad Porcina Gelpis, de la provincia de Matanzas. Se utilizaron 200 cerdos mestizos, destetados a los 33 d, provenientes de reproductoras York-Land (YL), Large White-Landrace (LWxL), y sementales Duroc Jersey y L-3534, desde los 34 hasta los 76 d (42 d). El estudio tuvo lugar entre el 19 de noviembre al 30 de diciembre del 2018. Durante este período, se registró temperatura media de 26 ºC ± 2, mínima de 20 ºC ± 3 y máxima de 27 ºC ± 1. La humedad relativa promedio fue de 79 % ± 3. Se aplicó un diseño completamente aleatorizado, en el que se incluyeron cuatro tratamientos, de 50 animales cada uno: 1) control, dieta basal sin aditivos, 2) dieta basal + aditivo PROBIOLACTlL® (10 mL/animal/d), 3) dieta basal + aditivo SUBTILPROBIO® (10 mL/animal/d) y 4) dieta basal + mezcla de los aditivos PROBIOLACTlL® + SUBTILPROBIO® (5mL/animal/d de cada biopreparado).

La dosis de los aditivos se ajustó a 109 UFC. mL-1, que se mezclaron con agua para su homogenización. Los muestreos se realizaron a los 34, 45, 60 y 76 d.

Condiciones de alimentación y manejo. La composición de la dieta suministrada se muestra en la tabla 1. El alimento se proporcionó en forma de harina basada en maíz-soya, según NRC (2012)NRC (National Research Council). 2012. Nutrients Requirements of Pigs. 10th Ed. Ed. National Academy Press, Washington D.C., USA, p. 96, DOI: https://doi.org/10.17226/6016..

Las naves donde se alojaron los cerdos (sistema Flat Decks) se sometieron a una habilitación sanitaria, según lo establecido para estos animales (IIP 2008Instituto de Investigaciones Porcinas. 2008. Manual de procedimientos técnicos para la crianza porcina. Grupo de Producción Porcina, Ministerio de la Agricultura, La Habana, p. 84.). Se dispusieron 10 cerdos por corral, para un total de 20 corrales. El suministro de agua fue ad libitum y el consumo de alimentos se restringió según las normas de consumo establecidas para esta categoría (GRUPOR 2017GRUPOR. 2017. Boletín Anual de indicadores productivos en la producción porcina en Cuba. Ministerio de la Agricultura, La Habana, Cuba.).

Determinación del efecto de los biopreparados y la mezcla en los indicadores microbiológicos, productivos y de salud. Para los indicadores microbiológicos, a los 34, 45, 60 y 76 d, se tomaron muestras del contenido fecal (1 g) de 10 cerditos por tratamiento. Se homogenizaron en 9 mL de medio diluyente (Caldwell y Bryant 1966Caldwell, D.R. & Bryant, M.P. 1966. "Medium without fluid for non-selective enumeration and isolation of rumen bacteria". Applied and Environmental Microbiology, 14(5): 794-801, ISSN: 1098-5336. ) y se procesaron de inmediato en condiciones anaerobias (5 % de atmósfera de CO2). Para efectuar el conteo de bacterias ácido lácticas (BAL) y coliformes se realizaron diluciones seriadas de las muestras (1:10, p/v) en medio diluyente hasta 10-11. De estas diluciones, se utilizaron para las BAL 10-9, 10-10 y 10-11, y para coliformes 10-6,10-7 y 10-8. Cada una se replicó tres veces (0.5 mL) en placas que contenían medio de cultivo selectivo. Para coliformes se utilizó agar bilis rojo - violeta (OXOID) y para BAL, agar MRS (CONDO, España). Después de incubar a 37 ºC (durante 72 h para BAL y 24 h para coliformes), se realizó el conteo microbiano. El número de UFC se determinó bajo lupa por conteo visual de colonias. En los indicadores productivos y de salud, se evaluó el peso vivo de los cerdos todas las semanas y se calculó la ganancia media diaria (GMD), conversión alimentaria (CA) e incremento de peso (IP). También se observó cada día la incidencia de diarreas y la mortalidad en los animales.

Procesamiento estadístico. Para el análisis de los datos se utilizó el programa estadístico INFOSTAT, versión 2012 (Di Rienzo et al. 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. InfoStat version 2012 [Windows]. Grupo InfoStat, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Available: http://www.infostat.com.ar ). Para las variables productivas se aplicó un modelo de análisis de varianza simple, previa comprobación de la distribución normal de los datos y de la homogeneidad de varianza mediante las dócimas de Shapiro y Wilk (1965)Shapiro, S. & Wilk, B. 1965. "An análisis of variante test for normalita (complete simples)". Biometrika, 52(3-4): 591-611, ISSN: 1464-3510, DOI: https://doi.org/10.1093/biomet/52.3-4.591. y de Levene (1960)Levene, H. 1960. Robust tests for the equality of variance. Contributions to Probability and Statistics. 1st Ed. Ed. Stanford University Press, Palo Alto, California, USA, p. 278-292. , respetivamente. Los conteos microbianos se transformaron a LN y posteriormente a √𝑋 , y se comprobó nuevamente la normalidad. Las diferencias entre grupos se verificaron por medio de la prueba de comparación de rangos múltiples de Duncan (1955)Duncan, D.B. 1955. "Multiple range and multiple F test". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 0006-341X, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478.. Los resultados de la incidencia de diarreas se analizaron mediante el programa ComparPro versión 1 (Font et al. 2007Font, H., Noda, A., Torres, V., Herrera, M., Lizazo, D., Sarduy, L. & Rodríguez, L. 2007. Paquete estadístico ComparPro versión 1. Departamento de Biomatemática, Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.).

En la figura 1 se muestra el efecto de PROBIOLACTIL®, SUBTILPROBIO® y su mezcla en el comportamiento de la población de coliformes y BAL en las heces fecales de cerdos en crecimiento. A los 34 d, no se presentaron diferencias en el conteo de estos grupos microbianos en los diferentes tratamientos. Sin embargo, a partir de los 45, hubo incremento (P < 0.05) de las BAL y disminución de los coliformes en los grupos en los que se aplicaron los biopreparados, con respecto al control. Además, se comprobó que de los aditivos utilizados, PROBIOLACTIL® fue el que provocó mayor aumento (P < 0.05) de la población de BAL.

La adición de este biopreparado, que contiene Lactobacillus salivarius, debió aumentar la población de BAL en el TGI, las cuales forman parte de la microbiota nativa de este ecosistema. De acuerdo con Pieper et al. (2006)Pieper, R., Janczyk, P., Schumann, R. & Souffrant, W.B. 2006. "The intestinal microflora of piglets around weaning-with emphasis on lactobacilli". Archiva Zootechnica, 9: 28-40, ISSN: 2344-4592., las especies Lactobacillus salivarius, L. fermentum y L. acidophilus son los lactobacilos más abundantes de la comunidad microbiana que habita en el íleon de los cerdos durante el período del destete.

Estos resultados indican que la aplicación del aditivo PROBIOLACTIL® en la dosis establecida provocó la colonización del tracto gastrointestinal de los cerdos en estudio. Muchos probióticos, especialmente las bacterias ácido lácticas, fermentan carbohidratos para producir ácidos grasos de cadena corta, como el ácido láctico y ácido acético, lo que disminuye el pH luminal a niveles en los que las bacterias potencialmente patógenas no se desarrollan (Segura y De Bloss 2000Segura, A. & De Bloss, M. 2000. La alternativa a los promotores del crecimiento. Memorias III Congreso Nacional de Avicultura. Centro de Convenciones Plaza América, Varadero, Cuba, p. 37-44.).

Se conoce además, que dichas bacterias producen bacteriocinas y peróxido de hidrógeno (Price y Lee 1970Price, R.J. & Lee, J.S. 1970. "Inhibition of Pseudomonas species by hydrogen peroxide producing lactobacilli". Journal of Milk and Food Technology, 33(1): 13-18, ISSN: 0022-2747, DOI: https://doi.org/10.4315/0022-2747-33.1.13. y Nazef et al. 2008Nazef, L., Belguesmia, Y., Tani, A., Prévost, H. & Drider, D. 2008. "Identification of lactic acid bacteria from poultry feces: evidence on anti-Campylobacter and anti-Listeria activities". Poultry Science, 87(2): 329-334, ISSN: 1525-3171, DOI: https://doi.org/10.3382/ps.2007-00282.). Por lo general, estas sustancias destruyen la integridad de la membrana citoplasmática mediante la formación de poros transmembranales, lo que provoca la salida de aminoácidos y ATP. Por tanto, no se genera el gradiente electroquímico ni se alcanza la fuerza protomotriz necesaria para la síntesis de ATP (Bajagai et al. 2016Bajagai, Y.S., Klieve, A.V., Dart, P.J. & Bryden, W.L. 2016. Probiotics in animal nutrition - Production, impact and regulation. Makkar, H.P.S (ed.). FAO Animal Production and Health Paper No. 179, Rome, Italy, ISBN: 978-92-5-109333-7. ).

Rondón et al. (2012)Rondón, A.J., Milián, G., Arteaga, F.G., Bocourt, R., Ranilla, M.J., Riaño, J., Samaniego, L.M., Rodríguez, Z., Pérez, M. & Rodríguez, M. 2012. "Identification and antimicrobial activity of Lactobacillus strains of poultry origin". Cuban Journal of Agricultural Science, 46(4): 403-409, ISSN: 2079-3480. determinaron in vitro que la especie Lactobacillus salivarius C-65 inhibió a Escherichia coli 0157:H7 a partir de la producción de ácidos y bacteriocinas. Se conoce que L. salivarius es un microorganismo muy prolífico en el intestino, por lo que es capaz de competir con muchas otros, entre los que se incluyen algunas bacterias patógenas (Riboulet-Bisson et al. 2012Riboulet-Bisson, E., Sturme, M., Jeffery, I., O'Donnell, M., Neville, B., Forde, B., Claesson, M.; Harris, H., Gardiner, G., Casey, P., Lawlor, P., O'Toole, P. & Ross, R. 2012. "Effect of Lactobacillus salivarius bacteriocin Abp118 on the mouse and pig intestinal microbiota". PLoS One, 7(2): e31113, ISSN: 1932-6203, DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0031113.). Entre ellas, L. salivarius se caracteriza por ser una bacteria probiótica muy eficaz, ya que desarrolla una función muy importante en el mantenimiento del sistema digestivo de forma saludable.

En la figura 2 se muestra el comportamiento del peso vivo en los animales evaluados, con el uso del PROBIOLACTIL®, el SUBTILPROBIO® y su mezcla durante la preceba. Se observó incremento del peso vivo (P < 0.05) en los cerdos que se trataron con los biopreparados con respecto al grupo control. Este aumento se observó a partir de los 11 d de aplicado, lo cual se corresponde con los 45 d de nacidos. En relación con el control, se comprobó que a partir de esa edad, hasta los 76 d, se produjo aumento del peso en todos los tratamientos en los que se aplicaron los biopreparados. Sin embargo, los mejores resultados se lograron con la administración del PROBIOLACTIL®, seguido del SUBTILPROBIO® y la mezcla de ambos.

Los mejores resultados se obtuvieron en los cerdos tratados con PROBIOLACTIL®. Este biopreparado contiene Lactobacillus salivarius C-65, microorganismo que se encuentra en el tracto digestivo de diferentes animales de interés zootécnico.

Iñiguez-Palomares et al. (2007)Iñiguez-Palomares, C. 2007. Identificación de interacciones tipo adhesina-carbohidrato en la adherencia de Lactobacillus probióticos a la mucosa intestinal de lechones. PhD Thesis. Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C., Hermosillo, Sonora, México. Available: <https://ciad.repositorioinstitucional.mx/jspui/>, [Consulted: December 2nd, 2019]. aislaron ocho cepas de Lactobacillus del TGI de cerdos que poseían potencial probiótico, debido a su resistencia a las barreras del tránsito gastrointestinal, a la propiedad de adherirse a la mucosa intestinal y a la actividad antibacteriana ante microorganismos patógenos. Sin embargo, L. salivarius fue la especie que cumplió con todos los criterios para ser seleccionada como probiótico.

Los resultados de este estudio están en correspondencia con criterios de autores que plantean que con la utilización de los aditivos zootécnicos se incrementa la retención aparente de los nutrientes incluidos en la dieta (cantidad de nutrientes consumidos menos la cantidad de nutrientes excretados) y se favorece la retención de N, P y Ca (Ángel et al. 2005Ángel, R., Dalloul, R.A. & Doerr, J. 2005. "Metabolism and nutrition: Performance of broiler chickens fed diets supplemented with a direct-fed microbial". Poultry Science, 84(8):1222-1231, ISSN: 1525-3171, DOI: https://doi.org/10.1093/ps/84.8.1222.). La suplementación de Lactobacillus produce el aumento de la actividad de las enzimas digestivas, como la β-galactosidasa, que estimula la peristalsis gastrointestinal y promueve la digestibilidad de los nutrientes (Zhao y Kim 2015Zhao, P.Y. & Kim, I.H. 2015. "Effect of direct-fed microbial on growth performance, nutrient digestibility, fecal noxious gas emission, fecal microbial flora and diarrhea score in weanling pigs". Animal Feed Science and Technology, 200: 86-92, ISSN: 0377-8401, DOI: https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2014.12.010.).

En la tabla 2 se muestra el comportamiento de los indicadores productivos en los cerdos que consumieron los diferentes biopreparados.

Estos resultados son similares a los observados por Dowarah et al. (2018)Dowarah, R., Verma, A.K., Agarwal, N., Singh, P. & Singh, B.R. 2018. "Selection and characterization of probiotic lactic acid bacteria and its impact on growth, nutrient digestibility, health and antioxidant status in weaned piglets". PloS One, 13(3): e0192978, ISSN: 1932-6203, DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192978., quienes describieron que la suplementación de probióticos a cerdos en crecimiento mejoró la GMD y la CA durante 180 d. Estos criterios demuestran que cuando se utilizan estos microorganismos se produce mejor aprovechamiento de los nutrientes contenidos en la dieta.

En la tabla 3 se muestran los resultados de la incidencia de diarreas durante el experimento. Estos se pueden asociar a diferentes mecanismos de acción propuestos para los probióticos, entre los que se incluyen la normalización de la población microbiana alterada, el mejoramiento de la barrera inmunológica intestinal, particularmente mediante la respuesta de IgA secretoria, y la disminución de las respuestas inflamatorias intestinales (Zhang et al. 2011Zhang, J., Deng, J., Wang, Z., Che, C., Li, Y. & Yang, Q. 2011. "Modulatory effects of Lactobacillus salivarius on intestinal mucosal immunity of piglets". Current Microbiology, 62: 1623-1631, ISSN: 1432-0991, DOI: https://doi.org/10.1007/s00284-011-9906-4., Khare et al. 2018Khare, A., Thorat, G., Bhimte, A. & Yadav, V. 2018. "Mechanism of action of prebiotic and probiotic". Journal of Entomology and Zoology Studies, 6(4): 51-53, ISSN: 2320-7078. y Plaza et al. 2019Plaza, J., Ruiz-Ojeda, F.J., Gil-Campos, M. & Gil, A. 2019. "Mechanisms of action of probiotics". Advances in Nutrition, 10(1): 49-66, ISSN: 2156-5376, DOI: https://doi.org/10.1093/advances/nmy063.).

La incidencia de diarreas mostró valores más bajos en los animales que consumieron los aditivos, resultado que coincide con los trabajos de Lu et al. (2018)Lu, X., Zhang, M., Zhao, L., Ge, K., Wang, Z., Jun, L. & Ren, F. 2018. "Growth performance and post-weaning diarrhea in piglets fed a diet supplemented with probiotic complexes". Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(11): 1791-1799, ISSN: 1738-8872, DOI: https://doi.org/10.4014/jmb.1807.07026., quienes refieren la reducción de la mortalidad y la presencia de animales con diarreas cuando se aplican probióticos. Kim et al. (2018)Kim, J., Kim, J., Kim, Y., Oh, S., Song, M., Hwan, J., Whang, K., Hyun, K. & Oh, S. 2018. "Influences of quorum‐quenching probiotic bacteria on the gut microbial community and immune function in weaning pigs". Animal Science Journal, 89(2): 412-422, ISSN: 1740-0929, DOI: https://doi.org/10.1111/asj.12954. investigaron la dinámica de la diversidad microbiana intestinal durante el destete de cerdos, después de administrar alimento suplementado con bacterias probióticas. Los resultados del bioensayo indicaron que en presencia de Lactobacillus acidophilus 30SC, la actividad de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) O157: H7 se inhibió, mientras que la población de lactobacilos aumentó en los cerdos destetados.

Otros investigadores, como Deng et al. (2013)Deng, J., Li, Y., Zhang, J. & Yang, Q. 2013. "Co-administration of Bacillus subtilis RJGP16 and Lactobacillus salivarius B1 strongly enhances the intestinal mucosal immunity of piglets". Research in Veterinary Science, 94(1): 62-68, ISSN: 0034-5288, DOI: https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2012.07.025., también aplicaron una mezcla de Bacillus RJGP16 y Lactobacillus salivarius B1 para evaluar su efecto en la estimulación del sistema immune de cerdos. Observaron el aumento de la producción de interleuquina (IL)-6 y las beta-defensinas porcinas (pBD)-2 en el duodeno y el íleon (P < 0.01). También constataron incremento en el número de immunoglobulina (Ig) A (P < 0.01) en el lumen intestinal. Todas estas acciones contribuyen a la disminución de microorganismos potencialmente patógenos, causantes de la presencia de diarreas.

Con respecto a estos resultados, se plantea que los microorganismos probióticos crean un complejo con las bacterias propias del animal para favorecer los mecanismos de defensa, la producción de sustancias antimicrobianas, la disminución del pH intestinal, el antagonismo bacteriano y la estimulación de la actividad de macrófagos y linfocitos, lo que influye en mejores rendimientos productivos (Bajagai et al. 2016Bajagai, Y.S., Klieve, A.V., Dart, P.J. & Bryden, W.L. 2016. Probiotics in animal nutrition - Production, impact and regulation. Makkar, H.P.S (ed.). FAO Animal Production and Health Paper No. 179, Rome, Italy, ISBN: 978-92-5-109333-7. y Markowiak y Śliżewska 2018Markowiak, P. & Śliżewska, K. 2018. "The role of probiotics, prebiotics and synbiotics in animal nutrition". Gut Pathogens, 10, 21, ISSN: 1757-4749, DOI: https://doi.org/10.1186/s13099-018-0250-0.).

Resultados similares a los de este estudio obtuvieron Dowarah et al. (2017)Dowarah, R., Verma, A.K. & Agarwal, N. 2017. "The use of Lactobacillus as an alternative of antibiotic growth promoters in pigs: A review". Animal Nutrition, 3(1): 1-6, ISSN: 2405-6545, DOI: https://doi.org/10.1016/j.aninu.2016.11.002., quienes evaluaron la eficacia de dos probióticos (Lactobacillus acidophilus NCDC-15 y Pediococcus acidilactici FT28) en el incremento de peso, la incidencia de diarreas, la composición de la microbiota intestinal y la salud de los cerdos. Estos autores concluyeron que la suplementación de estos aditivos en la dieta basal mejoró el rendimiento del crecimiento, el recuento microbiano fecal y la morfología intestinal en cerdos. Además, consideraron que la cepa P. acidilactici FT28 fue más efectiva en la reducción de las diarreas y el mantenimiento del ambiente ácido del tracto digestivo, lo que indica un efecto probiótico sinérgico entre estas bacterias y la microbiota intestinal para promover la salud del animal.

Estos resultados pueden estar dados porque los lactobacilos, a diferencia de Bacillus, tienen la capacidad de colonizar y adherirse a la mucosa intestinal, inhibiendo así a los microorganismos potencialmente patógenos. Producen ácidos orgánicos y mantienen la integridad de las células epiteliales. Además, se pueden multiplicar en condiciones anaerobias y permanecer viables durante 28 d, después de suspender el tratamiento; también activan el sistema inmune y mejoran la salud del hospedero (Blajman et al. 2015Blajman, J., Gaziano, C., Zbruna, M.C., Soto, L., Astesana, D., Berisvil, A., Romero, A., Signorini, M. & Frizzo, L. 2015. "In vitro and in vivo screening of native lactic acid bacteria toward their selection as a probiotic in broiler chickens". Research in Veterinary Science, 101: 50-56, ISSN: 0034-5288, DOI: https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2015.05.017., Pluske et al. 2018Pluske, J.R., Kim, J.C. & Black, J.L. 2018. "Manipulating the immune system for pigs to optimise performance". Animal Production Science, 58(4): 666-680, ISSN: 1836-5787, DOI: https://doi.org/10.1071/AN17598. y Hernández et al. 2019Hernández-García, J.E., Frizzo, L., Rodríguez-Fernández, J.C., Valdez-Paneca, G., Virginia-Zbrun, M., & Calero-Herrera, I. 2019. "Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77". Revista de Salud Animal, 41(1): 1-13, ISSN: 2224-4700. ). Con respecto a los resultados de la mezcla, se evidencia la necesidad de evaluar dosis superiores a las establecidas para cada aditivo, con el propósito de analizar su efecto en los animales.

Los resultados confirman el potencial probiótico que tienen estos biopreparados, cuando se aplican a cerdos durante la etapa de crecimiento, con mejores efectos en los que consumieron PROBIOLACTIL, un probiótico constituido por Lactobacillus salivarius.