Cuban Journal of Agricultural Science Vol. 58, January-December 2024, ISSN: 2079-3480
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Animal Science

Saccharomyces cerevisiae hydrolyzate: its effect on the in vitro ruminal microbial population of star grass (cynodon nlemfuensis)

 

iDJuana Galindo1Instituto de Ciencia Animal, C. Central, km 47 ½, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba*✉:juanaluzgblanco@gmail.com

iDNiurca González2Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, Calle 3ra No. 40759 e/ 6ta y Carretera a Tirabeque, Reparto la Unión, Boyeros, La Habana, Cuba

iDYoandra Marrero2Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, Calle 3ra No. 40759 e/ 6ta y Carretera a Tirabeque, Reparto la Unión, Boyeros, La Habana, Cuba

iDMarlen Rodríguez3Universidad de Matanzas, Carretera a Varadero, km 2 ½. Código postal: 40100, Matanzas, Cuba

iDMagaly Herrera1Instituto de Ciencia Animal, C. Central, km 47 ½, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba


1Instituto de Ciencia Animal, C. Central, km 47 ½, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

2Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, Calle 3ra No. 40759 e/ 6ta y Carretera a Tirabeque, Reparto la Unión, Boyeros, La Habana, Cuba

3Universidad de Matanzas, Carretera a Varadero, km 2 ½. Código postal: 40100, Matanzas, Cuba

 

*Email:juanaluzgblanco@gmail.com

An experiment was carried out with the hydrolyzate of Saccharomyces cerevisiae, registered as PROBIOLEV®, obtained in Cuba from the hydrolysis of distillery cream from the enzymatic crude of Bacillus subtilis E-44, to determine its effect on the ruminal microbial population of star grass (C. nlemfuensis). The in vitro gas production technique was applied, with modifications according to the proposed objective. Three treatments were established: A) star grass control, B) star grass + yeasts cream and C) star grass + yeasts hydrolyzate. The doses of cream and hydrolyzate were 100 mL/kg of concentrate/day, equivalent to 130 mg of (β 1.3) glucan/kg of concentrate. Samplings were done before incubation, and at 3 and 6 hours after incubation. The hydrolyzate activated the total bacterial populations (P=0.0088) by 62 %, which corresponds to 19.36 x 1011 CFU/mL more of bacteria, which means an increase in bacterial biomass. Cellulolytic bacteria were more numerous (P=0.0042) and the total number of cellulolytic fungi increased (P=0.0009) with the hydrolyzate. There was no effect of time on the total viable bacteria, cellulolytic bacteria and cellulolytic fungi. It is concluded that the hydrolyzate produces changes in the ruminal population, increasing the population of total viable bacteria, bacteria and cellulolytic fungi, an event that could favor the degradation of the fiber contained in the star grass.

Key words: 
cellulolytic, fungi, proteolytic, PROBIOLEV ®, total bacteria

Received: 28/12/2023; Accepted: 03/4/2024

Conflict of interest: The authors declare that there is no conflict of interest between them.

CRediT authorship contribution statement: Juana Galindo: Conceptualization, Data curation, Investigation, Formal analysis, Writing - original draft. Niurca González: Data curation, Investigation. Yoandra Marrero: Data curation, Investigation. Marlen Rodríguez: Data curation. Magaly Herrera: Formal analysis

CONTENT

Introduction

 

Most studies with yeasts in ruminant feeding have been carried out using live yeasts (Marrero et al. 2015Marrero, Y., Montoya, C. A., Ruiz, O., Elías, A. & Madera, N. 2015. Growth of Pichia guilliermondii strain Levica 27 in different energy sources and nitrogen. Cuban Journal of Agricultural Science, 49(1): 47, ISSN: 2079-3480. and Marrero et al. 2020Marrero, Y., Galindo, J., Castillo, Y. & Ruiz, O. 2020. Development of yeast additives for feeding ruminants in Cuba. Cuban Journal of Agricultural Science, 54(4): 457-469, ISSN: 2079-3480.). However, the use of its hydrolyzates as additives in the ruminant feeding has been little explored, although it constitutes a promising way that make possible the activation of the ruminal microbial population, specifically the cellulolytic one, as well as the main sensitive sites of the complex ruminal ecosystem.

In S. cerevisiae, approximately 90 % of the cell wall is composed of polysaccharides, of 5-10 % of proteins and does not exceed 1 % of lipids, although the protein portion is relatively small and approximately 50 % of the cell wall is composed of glycoproteins (Klis et al. 2006Klis, F.M., Boorsma, P. & De Groot, J. 2006. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 23(3): 185-2002, ISSN: 1097-0061. https://doi.org/10.1002/yea.1349. and Díaz et al. 2018Díaz, A. 2018. Strategies for improving the nutritive value of conventional and organic forages. Tesis PhD. Universidad de León, Fac. de Veterinaria, Departamento Producción animal. España). According to these authors, the main components of the cell wall of these yeasts are mannan proteins and β-glucans, in more or less equal proportions, and a small amount of N-acetylglucosamine.

Among the raw matters available for the production of yeast wall derivatives, the waste from the alcohol industry (distillery creams or yeast creams, vinasses) constitutes a very aggressive pollutant for the environment. Approximately 12-15 L of wastewater/L is produced from distilled alcohol, with an annual production of 2.6 million m3. Its organic load is 60 - 150 g COD/L, approximately 1000 times greater than that permitted by environmental protection standards. These reasons justify its use to produce animal food through biotechnological procedures, which also constitutes a way to improve the environment and the ecological management of the alcohol industry.

Galindo et al. (2010Galindo, J., Diaz, A., González, N., Sosa, A., Marrero, Y., Aldana, A.I., Moreira, O., Bocourt, R., Torres, V., Sarduy, L. & Noda, A. 2010. Effect of hydrolized enzymatic product of Saccharomyces cerevisiae yeasts on the ruminal microbial population with substrate of Pennisetum prupureum vc. Cuba CT-115 under in vitro conditions. Cuban Journal of Agricultural Science. 44(3): 275–279, ISSN: 2079-3480., 2019Galindo, J., Rodriguez, M., Valenciaga, D., Milian, G., López, J.R., Díaz, A., Bocourt, R., García, R., Camacho, Y., Rondón, A.J., Perez, M., Marrero, Y., Gonzalez, N., Sosa, A. & Herrera, M. 2019. Hidrolizate de Saccharomyces cerevisiae (PROBIOLEV®): su efecto como activador de la fermentacion ruminal y produccion de leche vacuna . Premio CITMA Mayabeque.) suggested the hypothesis that the hydrolyzate obtained from these creams can be used in ruminant feeding under the concept of microbial additives. Microbial additives activate the microbial population that lives in the ruminants’ rumen, increasing the digestive use of food and the degradation of fiber (Valenciaga et al. 2019Valenciaga, D., López, J. R., Delgado, A., Galindo, J., Herrera, M. & Monteagudo, F. 2019. Effect of the enzymatic hydrolyzate of Saccharomyces cerevisiae yeast on the kinetics of ruminal degradation of nutrients of Cenchrus purpureus hybrid OM - 22 (Cenchrus purpureus x Cenchrus americanus) forage. Cuban Journal of Agricultural Science, 53(3): 249-262, ISSN: 2079-3480.). In addition, they can reduce methane production to that level and in that way provide an environmental service in two ways. These antecedents offer the possibility of thinking that the use of an enzymatic hydrolyzate of S. cerevisiae could favor the action of ruminal microorganisms in animals that intake fibrous diets. Hence, the objective of this study was to determine the effect of S. cerevisiae hydrolyzate on the ruminal microbial population of star grass.

Materials and Methods

 

The experiment was carried out at Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas municipality, Mayabeque province, Cuba, at 92 m o. s. l, 22053’ north latitude and 82002’ west longitude. The fercialitic soil, undulating, with 4.84% organic matter, 0.26 of total nitrogen, 40.59 ppm of phosphorus, 4.60 of calcium, 0.46 of magnesium and pH of 6.34.

Experimental treatments

 

A total of three treatments were evaluated according to a completely random design in a 3x3 factorial arrangement (three treatments and three sampling hours). The treatments were: A) control with star grass, B) star grass + yeast cream and C) star grass + yeast hydrolyzate. The cream and hydrolyzate doses were 100 mL/kg of concentrate/d, equivalent to 130 mg of (β 1.3) glucan/kg of concentrate.

The hydrolyzate and yeast cream were sprayed onto the commercial concentrate for dairy cows at the indicated dose. After homogeneous mixing, the product was ready for it use.

The remainder of the experimental diet consisted on star grass. Its chemical composition was 7.26, 74.57, 10.11, 0.42 and 0.18 for CP, NDF, ash, calcium and phosphorus, % DM, respectively (AOAC 2016AOAC. 2016. Official methods of analysis of AOAC International. 20. ed. ed., Rockville MD: AOAC International., Latimer, George W. Jr., ISBN: 9780935584875, Available at: http://www.worldcat.org/title/official-methods-of-analysis-of-aoac).

The yeast cream, raw matter from which the hydrolyzate was obtained, was removed from the Jesús Rabí sugar mill distillery in Matanzas province. The characterization of the chemical composition of the hydrolyzate was carried out according to the techniques described by the AOAC (2016)AOAC. 2016. Official methods of analysis of AOAC International. 20. ed. ed., Rockville MD: AOAC International., Latimer, George W. Jr., ISBN: 9780935584875, Available at: http://www.worldcat.org/title/official-methods-of-analysis-of-aoac and DM, OM, ash and TP are indicated. The fibrous fractions were analyzed by the Goering and van Soest (1970)Goering, H. & Van Soest, P.J. 1970. Forage fiber analysis. Agricultural Hand book. US Dept. Agriculture Washington, USA, No, 379. procedure. The crude protein (CP) was determined by the Kjeldahl method. Total reducing sugars (RS) were analyzed according to the 3.5-dinitro salicylic acid (DNS) colorimetric technique, where glucose was used as a standard sugar (Bernfeld 1955Bernfeld, P. 1955. Amylases α and β. Methods in Enzymology, 1: 149-158, ISSN: 1557-7988. https://doi.org/10.1016/0076-6879(55)01021-5.). Total carbohydrates quantification (TC) was performed using the phenol-sulfuric acid colorimetric technique (Dubois et al. 1956Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A. & Smith, F. 1956. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Analytical Chemistry, 28(3): 350-356, ISSN: 1520-6882. http://dx.doi.org/10.1021/ac60111a017.). The values ​​coincide with those reported by Rodríguez et al. (2017)Rodríguez, M. 2017. Evaluación de la capacidad antibacteriana de PROBIOLEV frente a bacterias patógenas. Tesis presentada en opción al título de Doctor en Ciencias Veterinarias. Matanzas, Cuba.: 19.39, 17.83, 82.17, 40.28, 38.54, 7.93 and 6.09 % of DM, ash, OM, CP, TPLW, RS, TC. Its pH was 5.56 and the TP/CP ratio was 95.68.

Experimental procedure

 

The experiment was conducted under in vitro conditions. The Theodorou et al. (1994)Theodorou, M.K, Williams, B.A., Dhanoa, M.S., McAllan, A.B. & France, J. 1994. A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminants feed. Animal Feed Science and Technology, 48(3-4): 185-197, ISSN: 1873-2216. https://doi.org/10.1016/0377-8401(94)90171-6. technique was used. As described, 100 mL sealed bottles were used to incubate food samples in ruminal fluid and a buffer medium. In each bottle, 0.5 g of the material to be evaluated (star grass), 50 mL of the mixture consisting of rumen fluid and buffer solution in a 1:3 ratio and the concentrate in equivalent quantities with the microbial additive (hydrolyzate or cream) were introduced. The fermentation bottles were previously sterilized at 121 °C and 1.5 a.t.m. for 15 min. The procedure was carried out in a CO2 atmosphere to ensure strict anaerobic conditions. The ruminal inoculum was obtained from four crossbred cows stabled and rumen cannulated, fed a diet of forage grass and 2 kg/day of commercial concentrate and free access to water. The ruminal fluid sample was collected through the cannula, with the help of a vacuum pump. It was kept in a hermetically sealed thermo until it was transferred to the rumen microbiology and molecular genetics laboratory at Instituto de Ciencia Animal. It was then filtered through muslin. To form the mixture to be fermented, the total ruminal fluid from the four Holstein crossbred cows was used, with the aim of eliminating the animal effect.

Sampling to determine microbial populations was carried out before incubation and at 3 and 6 hours after incubation (hour 0).

Culture techniques and microorganisms counting

 

The Hungate (1950)Hungate, R.D. 1950. The anaerobic mesophilic cellulolytic bacteria. Bacteriological Reviews, 14(1): 1-49, ISSN: 0005-3678. https://doi.org/10.1128/br.14.1.1-49.1950. culture technique was used in roll tubes and under strict anaerobic conditions. The inoculation of total viable bacteria and cellulolytic bacteria was carried out in the culture media of Caldwell and Bryant (1966)Caldwell, D.R. & Bryant, M.P. 1966. Medium without rumen fluid for non-selective enumeration and isolation of rumen bacteria. Applied Microbiology, 14(5): 794-801, ISSN: 2471-9315. https://doi.org/10.1128/am.14.5.794-801.1966., modified by Elías (1971)Elías, A. 1971. The rumen bacteria of animals fed on a high molasses urea diet. Tesis Dr. Cs. Aberdeen and Galindo (1988)Galindo, J. 1988. Efecto de la zeolita en la población de bacterias celulolíticas y su actividad en el rumen de animales que consumen ensilaje. Tesis Dr. C. Instituto de Ciencia Animal, La Habana, Cuba. For the determination of the fungal population, the Joblin culture medium (1981)Joblin, K. N. 1981. Isolation, enumeration and maintenance of rumen anaerobic fungi in roll tube. Applied and Environmental Microbiology, 42(6): 111-112, ISSN: 1098-5336. https://doi.org/10.1128/aem.42.6.1119-1122.1981. was used.

Statistical analysis

 

For data analysis, the methodology proposed by Herrera et al. (2015)Herrera, M., Bustillo, C.W. & Torres, V. 2015. Metodología para el análisis estadístico de diferentes tipos de variables que se miden en las investigaciones que utilizan diseños experimentales relacionados con los modelos de análisis de varianza paramétrico y no paramétrico. ISBN: 978-959-7171-57-7. was used. The theoretical assumptions of the analysis of variance were tested: normality of errors using the Shapiro and Wilk (1965)Shapiro, S. & Wilk, B. 1965. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika, 52: 591-611, ISSN: 1464-3510. https://doi.org/10.2307/2333709. test, homogeneity of variance using Levene (1960)Levene, H. 1960. Robust tests for the equality of variance. Contributions to Probability and Statistics. Stanford University Press: 278-292. test for the variables total bacteria, proteolytic bacteria, cellulolytic bacteria and cellulolytic fungi. All variables failed to fulfill these assumptions.

Subsequently, data transformation was used and did not improve their fulfilling, so analysis of variance was used, according to a non-parametric completely random design in a 3x3 Kruskal-Wallis factorial arrangement. In cases where the interaction was not significant, the main effects were reported and Fisher's LSD (1935)Fisher, R. 1935. The Design of Experiments. Biometrics Journal, 20 (2): 307–321, ISSN: 1541-0420. test was applied.

For data processing, the Infostat statistical package (Di Rienzo 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M., Robledo, C.W. InfoStat versión 2012. Grupo InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. URL http://www.infostat.com.ar.) was used. In cases where the interaction was not significant, the main effects were recorded.

Results

 

The yeast hydrolyzate evaluated has glucan oligosaccharide concentrations of 3.34 ± 0.35%. The cream from which it is made has similar concentrations of the above biomolecules, but they are only found in the yeast walls and are not available to the ruminal microorganisms in the product. From these values, the dose of 100 mL/kg of concentrate is equivalent to approximately 130 mg of β (1.3) glucan/kg of concentrate.

From the analysis of the results it can be reported that there was no significant interaction between the populations of total viable bacteria, proteolytic, cellulolytic and cellulolytic fungi with the fermentation time. Table 1 shows the main effects of treatments on these microbial groups. Yeast hydrolyzate activated the total viable bacterial populations of the rumen (P=0.0088) and its population differed from that found when supplementation was not used. The yeast cream produced intermediate values ​​of total bacteria, without showing differences between the control treatments and with hydrolyzate.

Table 1.  Effect of yeast hydrolyzate and the cream that gave rise to it on some physiological groups of rumen microorganisms
Treatments Variables Control Yeasts cream Yeasts hydrolyzate Significance
Total viable bacteria, 1011 CFU/mL 30.94b (4.48) SD=5.00 41.76ab (7.70) SD=7.69 50.30a (9.70) SD=7.23 P=0.0088
Proteolytic bacteria, 106 CFU/mL 41.06 (14.48) SD=15.79 36.76 (10.56) SD=5.67 41.06 (12.30) SD=5.48 P=0.3974
Cellulolytic bacteria , 106 CFU/mL 3.91b (3.74) SD=3.15 39.35b (5.11) SD=2.70 52.22a (8.48) SD=7.23 P=0.0042
Cellulolytic fungi, 105 TFU/mL 30.80b (2.33) SD=2.66 39.04b (2.52) SD=1.63 53.17a (4.63) SD=3.38 P=0.0009

() Means of the original data

a, b: means with different letters in the same row differ at p<0.05

CFU: colony -forming units, TFU: talo-forming units

In terms of viable rumen bacterial population numbers, the inclusion of doses as small as 100 mL/kg concentrate/d produces increases of 62 % of the total rumen bacterial population, which is equivalent to 19.36 x 1011 CFU/mL more bacteria, which means an increase in bacterial biomass.

The population of cellulolytic bacteria was significantly higher (P=0.0042) when was supplemented with yeast hydrolyzate compared to the cream from which it originated and to the control treatment without supplementation, which did not differ from each other (table 1). The total number of cellulolytic fungi increased (P=0.0009) with the presence of the hydrolyzate in the animals concentrate, when related to the treatment without supplementation and that supplemented with the S. cerevisiae yeast cream. The yeast hydrolyzate and the cream that gave rise to it had no effects on the population of proteolytic bacteria in the rumen.

In the research, there was not recorded effect of fermentation time on the populations of total viable bacteria, cellulolytic bacteria and cellulolytic fungi in the rumen (table 2). However, as shown in the table, proteolytic bacteria showed the lowest populations at 3 h after fermentation start of (P=0.0269).

Table 2.  Effect of fermentation time on some physiological groups of rumen microorganisms with yeast hydrolyzate and the cream that gave rise to it as ruminal activators
Indicators Sampling time, h Significance
0 3 6
Total viable bacteria, 1011 CFU/mL 45.83 (8.96) SD=5.79 38.76 (6.85) SD=7.47 38.41 (6.07) SD=5.72 P=0.3934
Proteolytic bacteria, 106 CFU/mL 46.87a (13.93) SD=9.71 31.24b (11.26) SD=13.76 44.89a (12.15) SD=5.63 P=0.0269
Cellulolytic bacteria, 106 CFU/mL 43.31 (4.59) SD=2.63 44.46 (7.41) SD=7.45 35.71 (4.59) SD=3.88 P=0.2913
Cellulolytic fungi, 105 TFU/mL 43.54 (3.59) SD=3.02 45.28 (3.78) SD=3.37 34.19 (2.11) SD=1.53 P=0.1217

Legend: () Means of the original data

a, b: means with different letters in the same row differ at p<0.05

CFU: colony -forming units, TFU: talo-forming units

Discussion

 

Many mechanisms have been described about how small doses of yeasts added to the diet of ruminants can stimulate microbial growth in the rumen (Marrero et al. 2015Marrero, Y., Montoya, C. A., Ruiz, O., Elías, A. & Madera, N. 2015. Growth of Pichia guilliermondii strain Levica 27 in different energy sources and nitrogen. Cuban Journal of Agricultural Science, 49(1): 47, ISSN: 2079-3480. and Marrero et al. 2020Marrero, Y., Galindo, J., Castillo, Y. & Ruiz, O. 2020. Development of yeast additives for feeding ruminants in Cuba. Cuban Journal of Agricultural Science, 54(4): 457-469, ISSN: 2079-3480.), a phenomenon that is linked to the quality and type of diet that the animals intake.

It has been reported that yeast cell walls may constitute approximately 30 % of the dry matter of the cell. At the structural level, it is made up of three groups of polysaccharides: mannose polymers or mannoproteins, up to 50 % of the DM; glucose polymers or β-glucans (1.3/1.6), up to 55 % of the DM and, to a lesser extent, N-acetyl-glucosamine or chitin polymers in 6 % of the DM of the cell wall (Díaz et al. 2017Díaz, A. Ranilla, M.J. & Saro, C. 2017. Influence of increasing doses of a yeast hydrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures and Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232: 129-138, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.08.011.).

One of the mechanisms that facilitate these biotechnological products is that the activating effect has its origin on the growth factors that yeasts provide for ruminal microorganisms, such as wall polysaccharides, B-complex vitamins, short-chain fatty acids (SCFA) and branched-chain fatty acids, provitamins and micronutrients (Chaucheyras-Durand 2006Chaucheyras-Durand, F. 2006. Effects and modes of action of live yeasts in the rumen. Biologia (Bratislava), 61/6: 741—750, ISSN: 1336-9563. https://doi.org/10.2478/s11756-006-0151-4. and Díaz et al. 2017Díaz, A. Ranilla, M.J. & Saro, C. 2017. Influence of increasing doses of a yeast hydrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures and Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232: 129-138, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.08.011.).

The stimulation of microbial growth, according to Chaucheyras-Durand (2006)Chaucheyras-Durand, F. 2006. Effects and modes of action of live yeasts in the rumen. Biologia (Bratislava), 61/6: 741—750, ISSN: 1336-9563. https://doi.org/10.2478/s11756-006-0151-4. and Díaz et al. (2017)Díaz, A. Ranilla, M.J. & Saro, C. 2017. Influence of increasing doses of a yeast hydrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures and Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232: 129-138, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.08.011., may be associated with the presence of two growth factors, located in the different cellular fractions of the yeast. One of them is thermolabile and has a lipid origin, and the other is thermostable, with a possible peptide origin. Rossi et al. (2004)Rossi, F., Di Lucia, D., Vicenti, P & Cocconcelli, S. 2004. Effects of peptidic factions from Saccharomyces cereviceae culture on growth and metabolism of the ruminal bacteria Megasphaera elsdenii. Animal Research, 53: 177-186, ISSN: 1627-3591. isolated two peptide fractions rich in lysine and histidine from S. cerevisiae, which were effective in stimulating the growth of the ruminal bacteria Megasphaera elsdenii, the main bacteria that ferments lactate in the rumen.

Other theories were postulated by those who found that malate present in yeasts is capable of stimulating the growth of some Gram-negative bacteria in the rumen. Newbold et al. (1996)Newbold, C.J., Wallace, R.J. & Mcintosh, F.M. 1996. Mode of action of the yeast Saccharomyces cerevisiae as feed additive for ruminants. British Journal of Nutrition, 76: 249-261, ISSN: 1475-2662. also found an increase in the population of cellulolytic bacteria and fiber digestion. All this results in an increase in microbial protein in the rumen, which helps to explain the beneficial effects observed when live yeasts or their hydrolyzates are included in the diet of animals.

Chaucheyras-Durand et al. (2008)Chaucheyras-Durand F., Walker, N.D. & Bach, A. 2008. Effects of active dry yeasts on the rumen microbial ecosystem: past, present and future. Animal Feed Science and Technology, 145: 5–26, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2007.04.019. showed the effectiveness of yeasts in influencing the growth and enzymatic activity of rumen fiber-fermenting microorganisms and reported in vitro stimulation of the fungus Neocallimastix frontalis by the provision by yeasts of thiamine and vitamin required by rumen fungi for zoosporogenesis. Also, these authors showed that yeasts stimulate the growth and enzymatic activity of glucosidase and hydrolase enzymes. The mentioned enzymes are present in fiber-fermenting bacteria, such as Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus spp and Butyrivibrio fibrisolvens, due to the supply of nutrients and vitamins they provide to this fibrolytic population.

In general, there are few studies that analyze the effect of yeast hydrolyzates on ruminant animals. Its specific mechanisms of action are not clearly defined. Galindo et al. (2010)Galindo, J., Diaz, A., González, N., Sosa, A., Marrero, Y., Aldana, A.I., Moreira, O., Bocourt, R., Torres, V., Sarduy, L. & Noda, A. 2010. Effect of hydrolized enzymatic product of Saccharomyces cerevisiae yeasts on the ruminal microbial population with substrate of Pennisetum prupureum vc. Cuba CT-115 under in vitro conditions. Cuban Journal of Agricultural Science. 44(3): 275–279, ISSN: 2079-3480., when evaluating the effect of two levels of enzymatic hydrolyzate of the S. cerevisiae yeast on the ruminal microbial population of animals that intake Cenchrus purpureum cv. Cuba CT-115, reported increases in the populations of total viable bacteria and cellulolytic bacteria under in vitro conditions. The level of 100 mL/kg of concentrate/day was the one that allowed obtaining the greatest increase in the population of total viable bacteria.

Unfortunately, the concentration of short-chain fatty acids (SCFA) could not be determined in this experiment. In this regard, Kettunen et al. (2016)Kettunen, K., Vuorenmaa, J., Gaffney, D. & Apajalahti, J. 2016. Yeast hydrolysate product enhances ruminal fermentation in vitro. Journal of Applied Animal Nutrition, 4, ISSN: 2049-257X. https://doi.org/10.1017/jan.2015.14.1-7. and Oeztuerk et al. (2016)Oeztuerk, H., Emre, M.B. & Breves, G. 2016. Effects of hydrolysed yeasts on ruminal fermentation in the rumen simulation technique (Rusitec). Veterinární Medicína, 61(4): 195-203. https://doi.org/10.17221/8820-VETMED. reported the efficacy of two S. cerevisiae yeast hydrolyzates, which stimulated the in vitro fermentation of different substrates and increased SCFA production. This aspect, in particular, should be the subject of future studies, since with this same product Díaz et al. (2011)Díaz Reyes, A., Ranilla García, M., SaroHiguera, José., Tejido Mediavilla, C., Pérez Quintana, M. & Carro Travieso, M.D. 2011. Influence of increasy dosis of a yeast hidrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures AND Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232:129-138, ISSN: 1520-6882. https://doi.org/10.1021/ac601a017. obtained increases in the total concentration of SCFA, propionic and butyric acid in sheep.

More recently, Díaz et al. (2017)Díaz, A. Ranilla, M.J. & Saro, C. 2017. Influence of increasing doses of a yeast hydrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures and Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232: 129-138, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.08.011. evaluated the effect of supplementation with S. cerevisiae hydrolyzate on fermentation indicators in RUSITEC fermenters with alfalfa hay and concentrate in a 1/1 ratio. These authors observed increases in microbial growth in the rumen, especially cellulolytic bacteria, with the addition of the hydrolyzate to the diet. This result corresponds to what has been suggested in the scientific literature about the activating effect of yeast strains on populations of total viable bacteria and cellulolytic bacteria, when these strains are used as additives in diets for ruminants (Herrera 2014Herrera, M. 2014. Métodos Estadísticos alternativos de análisis con variables discretas y categóricas en investigaciones agropecuarias. Tesis en opción al título de Doctor en Ciencias Veterinarias. Instituto de Ciencia Animal. Mayabeque, Cuba. 100 p. and Casas 2018Casas, S. 2018. Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus oryzae: estimuladores y modificadores de la fermentación y crecimiento microbiano ruminal. Artículo de revisión. Revista de Producción Animal, 30(2): 1-8, ISSN: 2224-7920.).

If it is take into account that the enzymatic hydrolyzate of S. cerevisiae is mainly composed of low molecular weight peptides, glucan and mannan oligosaccharides, vitamins, amino acids, nitrogenous bases, nucleosides and nucleotides, among other components, then it is evident that this product can exert a stimulating effect on the ruminal microbial population, just like live yeast strains, due to the presence of the mentioned substances present in the enzymatic hydrolyzate. This could directly affect the increase in the microbial population, specifically the cellulolytic one, and, as a consequence, increases in the ruminal degradability of the nutrients in the forage that the animals receive are obtained (Valenciaga et al. 2019Valenciaga, D., López, J. R., Delgado, A., Galindo, J., Herrera, M. & Monteagudo, F. 2019. Effect of the enzymatic hydrolyzate of Saccharomyces cerevisiae yeast on the kinetics of ruminal degradation of nutrients of Cenchrus purpureus hybrid OM - 22 (Cenchrus purpureus x Cenchrus americanus) forage. Cuban Journal of Agricultural Science, 53(3): 249-262, ISSN: 2079-3480.).

Conclusions

 

The yeast produces hydrolyzate make changes in the ruminal population, increasing the populations of total viable bacteria, bacteria and cellulolytic fungi, an event that could favor the degradation of the fiber contained in star grass.

Acknowledgments

 

Thanks to Onidia Moreira, Jorge Hernández, Aned Capó, Lucía Sarduy and Osvaldo Tuero for their valuable contributions to the research.

References

 

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Ciencia Animal

Hidrolizado de saccharomyces cerevisiae: su efecto en la población microbiana ruminal in vitro de pasto estrella (cynodon nlemfuensis)

 

iDJuana Galindo1Instituto de Ciencia Animal, C. Central, km 47 ½, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba*✉:juanaluzgblanco@gmail.com

iDNiurca González2Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, Calle 3ra No. 40759 e/ 6ta y Carretera a Tirabeque, Reparto la Unión, Boyeros, La Habana, Cuba

iDYoandra Marrero2Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, Calle 3ra No. 40759 e/ 6ta y Carretera a Tirabeque, Reparto la Unión, Boyeros, La Habana, Cuba

iDMarlen Rodríguez3Universidad de Matanzas, Carretera a Varadero, km 2 ½. Código postal: 40100, Matanzas, Cuba

iDMagaly Herrera1Instituto de Ciencia Animal, C. Central, km 47 ½, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba


1Instituto de Ciencia Animal, C. Central, km 47 ½, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

2Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, Calle 3ra No. 40759 e/ 6ta y Carretera a Tirabeque, Reparto la Unión, Boyeros, La Habana, Cuba

3Universidad de Matanzas, Carretera a Varadero, km 2 ½. Código postal: 40100, Matanzas, Cuba

 

*Email:juanaluzgblanco@gmail.com

Se realizó un experimento con el hidrolizado de Saccharomyces cerevisiae, registrado como PROBIOLEV®, obtenido en Cuba de la hidrólisis de la crema de destilería a partir del crudo enzimático de Bacillus subtilis E-44, para determinar su efecto en la población microbiana ruminal de pasto estrella (C. nlemfuensis). Se aplicó la técnica de producción de gases in vitro, con modificaciones según el objetivo propuesto. Se establecieron tres tratamientos: A) control de pasto estrella, B) pasto estrella + crema de levaduras y C) pasto estrella + hidrolizado de levaduras. Las dosis de crema e hidrolizado fueron 100 mL/kg de concentrado/día, equivalente a 130 mg de (β 1,3) glucano/kg de concentrado. Los muestreos se hicieron antes de incubar, y a las 3 y 6 horas después de la incubación. El hidrolizado activó las poblaciones totales de bacterias (P=0.0088) en 62 %, lo que corresponde a 19.36 x 1011 UFC/mL más de bacterias, lo que significa incremento en biomasa bacteriana. Las bacterias celulolíticas fueron más numerosas (P=0.0042) y el número total de hongos celulolíticos se incrementó (P=0.0009) con el hidrolizado. No hubo efecto del tiempo en las bacterias viables totales, celulolíticas y hongos celulolíticos. Se concluye que el hidrolizado produce cambios en la población ruminal, incrementa la población de bacterias viables totales, bacterias y hongos celulolíticos, evento que pudiera favorecer la degradación de la fibra contenida en el pasto estrella.

Palabras clave: 
bacterias totales, celulolíticas, hongos, proteolíticas, PROBIOLEV ®

Introducción

 

La mayoría de los estudios con levaduras en la alimentación de animales rumiantes se han realizado con el empleo de levaduras vivas (Marrero et al. 2015Marrero, Y., Montoya, C. A., Ruiz, O., Elías, A. & Madera, N. 2015. Growth of Pichia guilliermondii strain Levica 27 in different energy sources and nitrogen. Cuban Journal of Agricultural Science, 49(1): 47, ISSN: 2079-3480. y Marrero et al. 2020Marrero, Y., Galindo, J., Castillo, Y. & Ruiz, O. 2020. Development of yeast additives for feeding ruminants in Cuba. Cuban Journal of Agricultural Science, 54(4): 457-469, ISSN: 2079-3480.). Sin embargo, el uso de sus hidrolizados como aditivos en la alimentación de animales rumiantes ha sido poco explorado, aunque constituye una vía promisoria que posibilita la activación de la población microbiana ruminal, específicamente la celulolítica, así como los principales sitios sensibles del complejo ecosistema ruminal.

En S. cerevisiae, aproximadamente, 90 % de la pared celular está compuesta por polisacáridos, de 5-10 % de proteínas y no rebasa 1 % de lípidos, aunque la porción proteica es, relativamente, pequeña y, aproximadamente, 50 % de la pared celular está compuesta por glicoproteínas (Klis et al. 2006Klis, F.M., Boorsma, P. & De Groot, J. 2006. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 23(3): 185-2002, ISSN: 1097-0061. https://doi.org/10.1002/yea.1349. y Díaz et al. 2018Díaz, A. 2018. Strategies for improving the nutritive value of conventional and organic forages. Tesis PhD. Universidad de León, Fac. de Veterinaria, Departamento Producción animal. España). Según estos autores, los principales componentes de la pared celular de estas levaduras son manano proteínas y β- glucanos, en proporciones más o menos iguales y pequeña cantidad de N- acetilglucosamina

Entre las materias primas disponibles para la producción de derivados de pared de levadura, los residuos de la industria alcoholera (cremas de destilerías o cremas de levaduras, vinazas) constituyen un contaminante muy agresivo para el medio ambiente. Del alcohol destilado se producen, aproximadamente, de 12-15 L de aguas residuales/L con producción anual de 2.6 millones de m3. Su carga orgánica es 60 - 150 g DQO/L, aproximadamente, 1000 veces mayor que la permitida por la norma de protección del medio ambiente. Estas razones justifican su uso para producir alimento animal mediante procedimientos biotecnológicos, lo que constituye, además, una vía para mejorar el entorno y la gestión ecológica de la industria alcoholera.

Galindo et al. (2010Galindo, J., Diaz, A., González, N., Sosa, A., Marrero, Y., Aldana, A.I., Moreira, O., Bocourt, R., Torres, V., Sarduy, L. & Noda, A. 2010. Effect of hydrolized enzymatic product of Saccharomyces cerevisiae yeasts on the ruminal microbial population with substrate of Pennisetum prupureum vc. Cuba CT-115 under in vitro conditions. Cuban Journal of Agricultural Science. 44(3): 275–279, ISSN: 2079-3480., 2019Galindo, J., Rodriguez, M., Valenciaga, D., Milian, G., López, J.R., Díaz, A., Bocourt, R., García, R., Camacho, Y., Rondón, A.J., Perez, M., Marrero, Y., Gonzalez, N., Sosa, A. & Herrera, M. 2019. Hidrolizate de Saccharomyces cerevisiae (PROBIOLEV®): su efecto como activador de la fermentacion ruminal y produccion de leche vacuna . Premio CITMA Mayabeque.) sugirieron la hipótesis de que el hidrolizado que se obtiene de estas cremas se puede utilizar en la alimentación de animales rumiantes bajo el concepto de aditivos microbianos. Los aditivos microbianos activan la población microbiana que habita en el rumen de los rumiantes, incrementan la utilización digestiva de los alimentos y la degradación de la fibra (Valenciaga et al. 2019Valenciaga, D., López, J. R., Delgado, A., Galindo, J., Herrera, M. & Monteagudo, F. 2019. Effect of the enzymatic hydrolyzate of Saccharomyces cerevisiae yeast on the kinetics of ruminal degradation of nutrients of Cenchrus purpureus hybrid OM - 22 (Cenchrus purpureus x Cenchrus americanus) forage. Cuban Journal of Agricultural Science, 53(3): 249-262, ISSN: 2079-3480.). Además, pueden reducir la producción de metano a ese nivel y de esa manera, doblemente, brindan un servicio ambiental. Estos antecedentes ofrecen la posibilidad de pensar que la utilización de un hidrolizado enzimático de S. cerevisiae pudiera favorecer la acción de los microorganismos ruminales en animales que consumen dietas fibrosas. De ahí que el objetivo del trabajo que se presenta fue determinar el efecto de un hidrolizado de S. cerevisiae en la población microbiana ruminal de pasto estrella.

Materiales y Métodos

 

El experimento se desarrolló en el Instituto de Ciencia Animal, municipio San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba, a 92 m s.n.m., 22053’ latitud norte y 82002’ longitud oeste. El suelo fercialítico, ondulado, con 4.84 % de materia orgánica, 0.26 de nitrógeno total, 40.59 ppm de fósforo, 4.60 de calcio, 0.46 de magnesio y pH de 6.34.

Tratamientos experimentales

 

Se evaluaron tres tratamientos, según diseño completamente aleatorizado en arreglo factorial 3x3 (tres tratamientos y tres horas de muestreos). Los tratamientos fueron: A) control con pasto estrella, B) pasto estrella + crema de levaduras y C) pasto estrella + hidrolizado de levaduras. Las dosis de crema e hidrolizado fueron 100 mL/kg de concentrado/d, equivalente a 130 mg de (β 1,3) glucano/kg de concentrado.

El hidrolizado o la crema de levaduras se asperjaron sobre el concentrado comercial para vacas lecheras en la dosis señalada. Luego de un mezclado homogéneo, el producto quedó listo para su empleo.

El resto de la dieta experimental consistió en pasto estrella. Su composición química fue 7.26, 74.57, 10.11, 0.42 y 0.18 para la PB, FDN, ceniza, calcio y fósforo, % MS, respectivamente (AOAC 2016AOAC. 2016. Official methods of analysis of AOAC International. 20. ed. ed., Rockville MD: AOAC International., Latimer, George W. Jr., ISBN: 9780935584875, Available at: http://www.worldcat.org/title/official-methods-of-analysis-of-aoac).

La crema de levaduras, materia prima a partir de la cual se obtuvo el hidrolizado, se obtuvo de la destilería del central Jesús Rabí, de la provincia Matanzas. La caracterización de la composición química del hidrolizado se realizó según las técnicas descritas por la AOAC (2016)AOAC. 2016. Official methods of analysis of AOAC International. 20. ed. ed., Rockville MD: AOAC International., Latimer, George W. Jr., ISBN: 9780935584875, Available at: http://www.worldcat.org/title/official-methods-of-analysis-of-aoac y se indican MS, MO, cenizas y PV. Las fracciones fibrosas se analizaron por el procedimiento de Goering y van Soest (1970)Goering, H. & Van Soest, P.J. 1970. Forage fiber analysis. Agricultural Hand book. US Dept. Agriculture Washington, USA, No, 379.. La proteína bruta (PB) se determinó mediante el método de Kjeldalh. Los azúcares reductores totales (AR) se analizaron de acuerdo con la técnica colorimétrica del 3,5-dinitro salicílico (DNS), donde se empleó la glucosa como azúcar patrón (Bernfeld 1955Bernfeld, P. 1955. Amylases α and β. Methods in Enzymology, 1: 149-158, ISSN: 1557-7988. https://doi.org/10.1016/0076-6879(55)01021-5.). La cuantificación de carbohidratos totales (CT) se realizó mediante la técnica colorimétrica del fenol-sulfúrico (Dubois et al. 1956Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A. & Smith, F. 1956. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Analytical Chemistry, 28(3): 350-356, ISSN: 1520-6882. http://dx.doi.org/10.1021/ac60111a017.). Los valores coinciden con los informados por Rodríguez et al. (2017)Rodríguez, M. 2017. Evaluación de la capacidad antibacteriana de PROBIOLEV frente a bacterias patógenas. Tesis presentada en opción al título de Doctor en Ciencias Veterinarias. Matanzas, Cuba.: 19.39, 17.83, 82.17, 40.28, 38.54, 7.93 y 6.09 % de MS, cenizas, MO, PB, PV, AR CT. El pH del mismo fue de 5.56 y la relación PV/PB de 95.68.

Procedimiento experimental

 

El experimento se condujo en condiciones in vitro. Se utilizó la técnica de Theodorou et al. (1994)Theodorou, M.K, Williams, B.A., Dhanoa, M.S., McAllan, A.B. & France, J. 1994. A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminants feed. Animal Feed Science and Technology, 48(3-4): 185-197, ISSN: 1873-2216. https://doi.org/10.1016/0377-8401(94)90171-6.. Según describe, se emplearon botellas selladas de 100 mL para incubar las muestras de alimento en líquido ruminal y un medio tampón. En cada botella se introdujeron 0.5 g del material a evaluar (pasto estrella), 50 mL de la mezcla integrada por líquido de rumen y solución tampón en relación 1:3 y el concentrado en cantidades equivalentes con el aditivo microbiano (hidrolizado o crema). Los frascos de fermentación se esterilizaron previamente a 121 0C y 1.5 a.t.m. durante 15 min. El procedimiento se realizó en atmósfera de CO2 para garantizar las condiciones de estricta anaerobiosis. El inóculo ruminal se obtuvo a partir de cuatro vacas mestizas estabuladas y canuladas en rumen, alimentadas con una dieta de forraje de gramíneas y 2 kg/día de concentrado comercial y libre acceso al agua. La muestra de líquido ruminal se colectó a través de la cánula, con la ayuda de una bomba de vacío. Se conservó en un termo herméticamente cerrado hasta su traslado al laboratorio de microbiología y genética molecular del rumen en el Instituto de Ciencia Animal. Posteriormente, se filtró a través de muselina. Para conformar la mezcla que se iba a fermentar, se utilizó el total del líquido ruminal de las cuatro vacas mestizas de Holstein, con el propósito de eliminar el efecto animal.

La toma de muestras para la determinación de las poblaciones microbianas se efectuó antes de incubar y a las 3 y 6 h posteriores al momento de la incubación (hora 0).

Técnicas de cultivo y conteos de microorganismos

 

Se utilizó la técnica de cultivo de Hungate (1950)Hungate, R.D. 1950. The anaerobic mesophilic cellulolytic bacteria. Bacteriological Reviews, 14(1): 1-49, ISSN: 0005-3678. https://doi.org/10.1128/br.14.1.1-49.1950. en tubos roll y en condiciones de anaerobiosis estricta. La siembra de bacterias viables totales y celulolíticas se efectuó en los medios de cultivo de Caldwell y Bryant (1966)Caldwell, D.R. & Bryant, M.P. 1966. Medium without rumen fluid for non-selective enumeration and isolation of rumen bacteria. Applied Microbiology, 14(5): 794-801, ISSN: 2471-9315. https://doi.org/10.1128/am.14.5.794-801.1966., modificados por Elías (1971)Elías, A. 1971. The rumen bacteria of animals fed on a high molasses urea diet. Tesis Dr. Cs. Aberdeen y Galindo (1988)Galindo, J. 1988. Efecto de la zeolita en la población de bacterias celulolíticas y su actividad en el rumen de animales que consumen ensilaje. Tesis Dr. C. Instituto de Ciencia Animal, La Habana, Cuba. Para la determinación de la población de hongos se utilizó el medio de cultivo de Joblin (1981)Joblin, K. N. 1981. Isolation, enumeration and maintenance of rumen anaerobic fungi in roll tube. Applied and Environmental Microbiology, 42(6): 111-112, ISSN: 1098-5336. https://doi.org/10.1128/aem.42.6.1119-1122.1981..

Análisis estadístico

 

Para el análisis de los datos se empleó la metodología propuesta por Herrera et al. (2015)Herrera, M., Bustillo, C.W. & Torres, V. 2015. Metodología para el análisis estadístico de diferentes tipos de variables que se miden en las investigaciones que utilizan diseños experimentales relacionados con los modelos de análisis de varianza paramétrico y no paramétrico. ISBN: 978-959-7171-57-7.. Se probaron los supuestos teóricos del análisis de varianza: normalidad de los errores por la dócima de Shapiro y Wilk (1965)Shapiro, S. & Wilk, B. 1965. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika, 52: 591-611, ISSN: 1464-3510. https://doi.org/10.2307/2333709., homogeneidad de varianza por la de Levene (1960)Levene, H. 1960. Robust tests for the equality of variance. Contributions to Probability and Statistics. Stanford University Press: 278-292. para las variables bacterias totales, proteolíticas, celulolíticas y hongos celulolíticos. Todas las variables incumplieron con dichos supuestos.

Posteriormente, se empleó la transformación de los datos y no mejoraron su cumplimiento, por lo que se empleó análisis de varianza, según diseño completamente aleatorizado no paramétrico en arreglo factorial 3x3 Kruskal-Wallis. En los casos donde la interacción no fue significativa, se informaron los efectos principales y se aplicó la dócima LSD de Fisher (1935)Fisher, R. 1935. The Design of Experiments. Biometrics Journal, 20 (2): 307–321, ISSN: 1541-0420..

Para el procesamiento de los datos, se utilizó el paquete estadístico Infostat (Di Rienzo 2012Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M., Robledo, C.W. InfoStat versión 2012. Grupo InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. URL http://www.infostat.com.ar.). En los casos donde la interacción no fue significativa, se registraron los efectos principales.

Resultados

 

El hidrolizado de levaduras que se evaluó presenta concentraciones de oligosacáridos de glucanos de 3.34 ± 0.35 %. La crema que le dio origen tiene concentraciones de las referidas biomoléculas en concentraciones similares, solo que se encuentran en las paredes de las levaduras y no disponibles a los microrganismos ruminales en el producto. A partir de esos valores, la dosis de 100 mL/kg de concentrado equivale, aproximadamente, a 130 mg de β (1,3) glucano/kg de concentrado.

Del análisis de los resultados se puede informar que no hubo interacción significativa entre las poblaciones de bacterias viables totales, proteolíticas, celulolíticas y hongos celulolíticos con el tiempo de fermentación. La tabla 1 muestra los efectos principales de los tratamientos en estos grupos microbianos. El hidrolizado de levaduras activó las poblaciones de bacterias viables totales del rumen (P=0.0088) y su población difirió de la encontrada cuando no se utilizó suplementación. La crema de levaduras propició valores intermedios de bacterias totales, sin manifestar diferencias entre los tratamientos control y con hidrolizado.

Tabla 1.  Efecto del hidrolizado de levaduras y la crema que le dio origen en algunos grupos fisiológicos de microorganismos del rumen
Tratamientos Variables Control Crema de levaduras Hidrolizado de levaduras EE± Significación
Bacterias totales viables, 1011 UFC/mL 30.94b (4.48) DE=5.00 41.76ab (7.70) DE=7.69 50.30a (9.70) DE=7.23 P=0.0088
Bacterias proteolíticas, 106 UFC/mL 41.06 (14.48) DE=15.79 36.76 (10.56) DE=5.67 41.06 (12.30) DE=5.48 P=0.3974
Bacterias celulolíticas, 106 UFC/mL 3.91b (3.74) DE=3.15 39.35b (5.11) DE=2.70 52.22a (8.48) DE=7.23 P=0.0042
Hongos celulolíticos, 105 UFT/mL 30.80b (2.33) DE=2.66 39.04b (2.52) DE=1.63 53.17a (4.63) DE=3.38 P=0.0009

() Medias de los datos originales, EE: error estándar

a, b: medias con letras diferentes en la misma fila difieren a p<0.05

UFC: unidades formadoras de colonias, UFT: unidades formadoras de talo

En términos de número poblacional de bacterias viables del rumen, la inclusión de dosis tan pequeñas como 100 mL/kg concentrado/d produce incrementos del 62 % de la población total de bacterias del rumen, lo que equivale a 19.36 x 1011 UFC/mL más de bacterias, que significa incremento en biomasa bacteriana.

La población de bacterias celulolíticas fue significativamente más numerosa (P=0.0042) cuando se suplementó con el hidrolizado de levaduras con respecto a la crema que le dio origen y al tratamiento control sin suplementación, los que no difirieron entre sí (tabla 1). El número total de hongos celulolíticos se incrementó (P=0.0009) con la presencia del hidrolizado en el concentrado de los animales, cuando se relaciona con el tratamiento sin suplementar y con aquel suplementado con la crema de levaduras S. cerevisiae. El hidrolizado de levaduras y la crema que le dio origen no tuvieron efectos en la población de bacterias proteolíticas del rumen

En la investigación no se registró efecto del tiempo de fermentación en las poblaciones de bacterias viables totales, celulolíticas y hongos celulolíticos del rumen (tabla 2). Sin embargo, como muestra la tabla, las bacterias proteolíticas presentaron las menores poblaciones a las 3 h después de iniciada la fermentación (P=0.0269).

Tabla 2.  Efecto del tiempo de fermentación en algunos grupos fisiológicos de microorganismos del rumen con hidrolizado de levaduras y la crema que le dio origen como activadores ruminales
Indicadores Sampling time, h EE± Significación
0 3 6
Bacterias totales viables, 1011 UFC/mL 45.83 (8.96) DE=5.79 38.76 (6.85) DE=7.47 38.41 (6.07) DE=5.72 P=0.3934
Bacterias proteolíticas, 106 UFC/mL 46.87a (13.93) DE=9.71 31.24b (11.26) DE=13.76 44.89a (12.15) DE=5.63 P=0.0269
Bacterias celulolíticas, 106 UFC/mL 43.31 (4.59) DE=2.63 44.46 (7.41) DE=7.45 35.71 (4.59) DE=3.88 P=0.2913
Hongos celulolíticos, 105 UFT/mL 43.54 (3.59) DE=3.02 45.28 (3.78) DE=3.37 34.19 (2.11) DE=1.53 P=0.1217

Leyenda: () Medias de los datos originales, EE: Error estándar

a, b: medias con letras diferentes dentro de la misma fila difieren a p<0.05

UFC: unidades formadoras de colonias, UFT: unidades formadoras de talo

Discusión

 

Múltiples han sido los mecanismos descritos acerca de que pequeñas dosis de levaduras adicionadas a la dieta de los rumiantes pueden estimular el crecimiento microbiano en el rumen (Marrero et al. 2015Marrero, Y., Montoya, C. A., Ruiz, O., Elías, A. & Madera, N. 2015. Growth of Pichia guilliermondii strain Levica 27 in different energy sources and nitrogen. Cuban Journal of Agricultural Science, 49(1): 47, ISSN: 2079-3480. y Marrero et al. 2020Marrero, Y., Galindo, J., Castillo, Y. & Ruiz, O. 2020. Development of yeast additives for feeding ruminants in Cuba. Cuban Journal of Agricultural Science, 54(4): 457-469, ISSN: 2079-3480.), fenómeno que se vincula a la calidad y tipo de dieta que consumen los animales.

Se ha informado que las paredes celulares de las levaduras pueden constituir, aproximadamente, 30 % de la materia seca de la célula. A escala estructural, la misma se integra por tres grupos de polisacáridos: polímeros de manosa o mananoproteínas, hasta 50 % de la MS; polímeros de glucosa o β- glucanos (1.3/1.6), hasta 55 % de la MS y, en menor proporción, polímeros de N-acetil-glucosamina o quitina en 6 % de la MS de la pared celular (Díaz et al. 2017Díaz, A. Ranilla, M.J. & Saro, C. 2017. Influence of increasing doses of a yeast hydrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures and Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232: 129-138, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.08.011.)

Uno de los mecanismos que facilitan estos productos biotecnológicos subscriben que el efecto activador tiene su origen en los factores de crecimiento que aprovisionan las levaduras para los microorganismos ruminales, como polisacáridos de pared, las vitaminas del complejo B, los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y de cadena ramificada, las provitaminas y los micronutrientes (Chaucheyras-Durand 2006Chaucheyras-Durand, F. 2006. Effects and modes of action of live yeasts in the rumen. Biologia (Bratislava), 61/6: 741—750, ISSN: 1336-9563. https://doi.org/10.2478/s11756-006-0151-4. y Díaz et al. 2017Díaz, A. Ranilla, M.J. & Saro, C. 2017. Influence of increasing doses of a yeast hydrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures and Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232: 129-138, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.08.011.).

La estimulación del crecimiento microbiano, según refieren Chaucheyras-Durand (2006)Chaucheyras-Durand, F. 2006. Effects and modes of action of live yeasts in the rumen. Biologia (Bratislava), 61/6: 741—750, ISSN: 1336-9563. https://doi.org/10.2478/s11756-006-0151-4. y Díaz et al. (2017)Díaz, A. Ranilla, M.J. & Saro, C. 2017. Influence of increasing doses of a yeast hydrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures and Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232: 129-138, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.08.011. puede estar asociada a la presencia de dos factores de crecimiento, localizados en las diferentes fracciones celulares de la levadura. Uno de ellos termolábil de origen lipídico y otro termoestable con un posible origen peptídico. Rossi et al. (2004)Rossi, F., Di Lucia, D., Vicenti, P & Cocconcelli, S. 2004. Effects of peptidic factions from Saccharomyces cereviceae culture on growth and metabolism of the ruminal bacteria Megasphaera elsdenii. Animal Research, 53: 177-186, ISSN: 1627-3591. aislaron a partir de S. cerevisiae dos fracciones peptídicas ricas en lisina e histidina, que resultaron efectivas en estimular el crecimiento de la bacteria ruminal Megasphaera elsdenii, principal bacteria que fermenta el lactato a nivel de rumen.

Otras teorías se postularon por los que encontraron que el malato presente en las levaduras es capaz de estimular el crecimiento de algunas bacterias Gram negativas del rumen. También Newbold et al. (1996)Newbold, C.J., Wallace, R.J. & Mcintosh, F.M. 1996. Mode of action of the yeast Saccharomyces cerevisiae as feed additive for ruminants. British Journal of Nutrition, 76: 249-261, ISSN: 1475-2662. hallaron aumento, en la población de bacterias celulolíticas y la digestión de la fibra. Todo esto se revierte en un incremento en la proteína microbiana en el rumen que ayuda a explicar los efectos beneficiosos que se observan cuando se incluyen levaduras vivas o sus hidrolizados en la dieta de los animales.

Chaucheyras-Durand et al. (2008)Chaucheyras-Durand F., Walker, N.D. & Bach, A. 2008. Effects of active dry yeasts on the rumen microbial ecosystem: past, present and future. Animal Feed Science and Technology, 145: 5–26, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2007.04.019. demostraron la eficacia de las levaduras para influir en el crecimiento y la actividad enzimática de los microorganismos que fermentan la fibra en el rumen e informaron la estimulación in vitro del hongo Neocallimastix frontalis por el suministro que realizan las levaduras de tiamina y vitamina requeridas por los hongos del rumen para la zoosporogénesis. Además, estos autores indicaron que las levaduras estimulan el crecimiento y la actividad enzimática de las enzimas glucosidasas e hidrolasas. Las referidas enzimas se encuentran presentes en las bacterias que fermentan la fibra, como Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus spp y Butyrivibrio fibrisolvens, por el suministro que hacen de nutrientes y vitaminas para esta población fibrolítica.

En general, son pocos los trabajos que analizan el efecto de los hidrolizados de levaduras en animales rumiantes. Sus mecanismos de acción específicos no se definen claramente. Galindo et al. (2010)Galindo, J., Diaz, A., González, N., Sosa, A., Marrero, Y., Aldana, A.I., Moreira, O., Bocourt, R., Torres, V., Sarduy, L. & Noda, A. 2010. Effect of hydrolized enzymatic product of Saccharomyces cerevisiae yeasts on the ruminal microbial population with substrate of Pennisetum prupureum vc. Cuba CT-115 under in vitro conditions. Cuban Journal of Agricultural Science. 44(3): 275–279, ISSN: 2079-3480., al evaluar el efecto de dos niveles de hidrolizado enzimático de la levadura S. cerevisiae en la población microbiana ruminal de animales que consumen Cenchrus purpureum vc. Cuba CT- 115 informaron incrementos de las poblaciones de bacterias viables totales y de bacterias celulolíticas en condiciones in vitro. El nivel de 100 mL/kg de concentrado/día fue el que permitió obtener el mayor incremento de la población de bacterias viables totales.

Desafortunadamente, no se pudo determinar la concentración de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) en el presente experimento. Al respecto, Kettunen et al. (2016)Kettunen, K., Vuorenmaa, J., Gaffney, D. & Apajalahti, J. 2016. Yeast hydrolysate product enhances ruminal fermentation in vitro. Journal of Applied Animal Nutrition, 4, ISSN: 2049-257X. https://doi.org/10.1017/jan.2015.14.1-7. y Oeztuerk et al. (2016)Oeztuerk, H., Emre, M.B. & Breves, G. 2016. Effects of hydrolysed yeasts on ruminal fermentation in the rumen simulation technique (Rusitec). Veterinární Medicína, 61(4): 195-203. https://doi.org/10.17221/8820-VETMED. informaron la eficacia de dos hidrolizados de levadura S. cerevisiae, que estimularon la fermentación in vitro de diferentes sustratos y aumentaron la producción de AGCC. Este aspecto, en particular deberá constituir objeto de estudios futuros, debido a que con este mismo producto Díaz et al. (2011)Díaz Reyes, A., Ranilla García, M., SaroHiguera, José., Tejido Mediavilla, C., Pérez Quintana, M. & Carro Travieso, M.D. 2011. Influence of increasy dosis of a yeast hidrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures AND Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232:129-138, ISSN: 1520-6882. https://doi.org/10.1021/ac601a017. obtuvieron incrementos en la concentración total de AGCC, ácido propiónico y butírico en ovejos.

Más recientemente, Díaz et al. (2017)Díaz, A. Ranilla, M.J. & Saro, C. 2017. Influence of increasing doses of a yeast hydrolyzate obtained from sugarcane processing on in vitro rumen fermentation of two different diets and bacterial diversity in batch cultures and Rusitec fermenters. Animal Feed Science and Technology, 232: 129-138, ISSN: 2321-1628. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.08.011. evaluaron el efecto de la suplementacion con hidrolizado de S. cerevisiae en los indicadores fermentativos en fermentadores RUSITEC con heno de alfalfa y concentrado en relación 1/1. Estos autores constataron incrementos en el crecimiento microbiano en rumen, especialmente de bacterias celulolíticas, con la adición del hidrolizado en la dieta. Este resultado se corresponde con lo planteado en la literatura científica acerca del efecto activador de las cepas de levaduras en las poblaciones de bacterias viables totales y bacterias celulolíticas, cuando estas cepas se emplean como aditivos en dietas para rumiantes (Herrera 2014Herrera, M. 2014. Métodos Estadísticos alternativos de análisis con variables discretas y categóricas en investigaciones agropecuarias. Tesis en opción al título de Doctor en Ciencias Veterinarias. Instituto de Ciencia Animal. Mayabeque, Cuba. 100 p. y Casas 2018Casas, S. 2018. Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus oryzae: estimuladores y modificadores de la fermentación y crecimiento microbiano ruminal. Artículo de revisión. Revista de Producción Animal, 30(2): 1-8, ISSN: 2224-7920.).

Si se tiene en cuenta que el hidrolizado enzimático de S. cerevisiae está constituido, fundamentalmente, por péptidos de bajo peso molecular, oligosacáridos de glucanos y mananos, vitaminas, aminoácidos, bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos, entre otros componentes, entonces es evidente que este producto puede ejercer efecto estimulador de la población microbiana ruminal, al igual que las cepas de levaduras vivas, por la presencia de las referidas sustancias presentes en el hidrolizado enzimático. Ello pudiera incidir, directamente, en el incremento de la población microbiana, específicamente la celulolítica y, como consecuencia, se obtienen incrementos en la degradabilidad ruminal de los nutrientes del forraje que reciben los animales (Valenciaga et al. 2019Valenciaga, D., López, J. R., Delgado, A., Galindo, J., Herrera, M. & Monteagudo, F. 2019. Effect of the enzymatic hydrolyzate of Saccharomyces cerevisiae yeast on the kinetics of ruminal degradation of nutrients of Cenchrus purpureus hybrid OM - 22 (Cenchrus purpureus x Cenchrus americanus) forage. Cuban Journal of Agricultural Science, 53(3): 249-262, ISSN: 2079-3480.).

Conclusiones

 

El hidrolizado de levadura S. cerevisiae produce cambios en la población ruminal, incrementa las poblaciones de bacterias viables totales, bacterias y hongos celulolíticos, evento que pudiera favorecer la degradación de la fibra contenida en el pasto estrella.

Agradecimientos

 

Se agradece a Onidia Moreira, Jorge Hernández, Aned Capó, Lucía Sarduy y Osvaldo Tuero por sus valiosas contribuciones a la investigación.