Integrated management of the fertilization for <i>Tithonia diversifolia</i>forage production

pH H₂O	OM, %	P,	Ca²⁺	Mg²⁺	Na,⁺	K⁺	CIB
7.7	4.50	70	49.5	4.8	0.25	0.57	54.9
(7.5-7.8)	(4.25-4.76)	(65-76)	(47.3-51.7)	(4.1-5.2)	(0.22-0.28)	(0.51-0.63)	(53.7-56.4)

Results and Discussion

⌅

There was a significant effect of the addition of cattle manure on the contents of OM, P assimilable and K interchangeable of the soil (table 4), which was in correspondence with the amounts of this elements provide by the organic fertilizer. According to their composition, with each ton of manure (in humid base) there were incorporated to the soil 290 kg of OM, 3 kg of P and 9 kg of K, and this has effect, on the increase of their contents in the soil. The manure did not have effects on the pH, probably due to the alkaline reaction of the soil and to the neutral pH of the manure.

Table 4. Effect of the nitrogen fertilization, biofertilization and the application of cattle manure on the contents of OM, pH, P assimilable and K interchangeable of the soil.

Treatments			OM, %	pH, H₂O	P, mg kg^-1	K, cmol_c kg^-1
N, kg ha^-1 year	Cattle manure, t ha^-1	Biofertilization	OM, %	pH, H₂O	P, mg kg^-1	K, cmol_c kg^-1
0	0	NB	4.40^b	7.5	62^b	0.57^b
70	0	NB	4.50^b	7.7	65^b	0.62^b
100	0	NB	4.36^b	7.5	61^b	0.52^b
0	0	B	4.62^b	7.6	70^b	0.58^b
70	0	B	4.35^b	7.4	63^b	0.61^b
100	0	B	4.39^b	7.6	67^b	0.53^b
0	25	B	5.46^a	7.7	116^a	1.28^a
70	25	B	5.54^a	7.8	121^a	1.31^a
100	25	B	5.49^a	7.6	118^a	1.26^a
SE±			0.21	0.2	6	0.15
P			0.0001	0.332	0.0001	0.0002

NB: non biofertilized. B: biofertilized with Azospirillum brasilense + Rhizoglomus irregulare. Averages with common letters in the same row did not significantly differ, according to Tukey (P<0.05) test

Although the benefits of the applications of cattle manure in the soil fertility are known, their inclusion in the fertilization systems of forages crops continues being an acceptable strategy by the many environmental services that generates in the cattle agroecosystems by their contribution to the recycle of nutrients which are extracted from the soil with the biomass intake by the animals, as well as by their direct impact in the reduction of the pollutant effect that their incorrect use cause (Sileshi et al. 2019Sileshi, G.W., Jama, B., Vanlauwe, B., Negassa, W., Harawa, R., Kiwia, A. & Kimani, D. 2019. Nutrient use efficiency and crop yield response to the combined application of cattle manure and inorganic fertilizer in sub-Saharan Africa. Nutrient Cycling in Agroecosystems, 113: 181-199, ISSN: 1385-1314. https://doi.org/10.1007/s10705-019-09974-3.).

Table 5 show the effect of treatments on the fungi variables in the moment of the second and fourth cut. In the second one, the join application of both biofertilizers, alone or with N, increased the frequency and intensity of the colonization, as well as the number of spores in the rhizosphere with relation to the non biofertlizers treatments. However, these variables reached the highest values with the application of the biofertilizers combine with the cattle manure, except where the higher dose of N was added.

Table 5. Effect of the nitrogen fertilization, biofertilization and the application of cattle manure on the fungi structures of Tithonia in the moment of the second and fourth cut

Treatments			Second cut, February 2019		Fourth cut, July 2020
N, kg ha^-1 year	Cattle manure, t ha^-1	Bio- fertilization	Colonization frequency, %	Colonization intensity, %	Spores/ 50 g	Colonization frequency, %	Colonization intensity , %	Spores/ 50 g
0	0	NB	23.9^c	3.15^c	87^c	33.7^d	3.27^d	125^d
70	0	NB	22.8^c	2.89^c	92^c	34.3^d	2.93^d	132^d
100	0	NB	21.3^c	3.19^c	89^c	33.9^d	3.19^d	129^d
0	0	B	34.7^b	4.63^b	223^b	41.4^c	4.53^c	313^c
70	0	B	33.9^b	4.61^b	225^b	52.7^b	5.55^b	473^b
100	0	B	33.5^b	4.57^b	237^b	51.9^b	5.38^b	451^b
0	25	B	38.3^a	5.91^a	393^a	64.2^a	6.75^a	613^a
70	25	B	39.5^a	6.22^a	418^a	63.8^a	6.97^a	587^a
100	25	B	34.9^b	4.59^b	242^b	40.5^c	4.39^c	309^c
SE±			1.6	0.28	23.5	1.8	0.26	32
P			0.0001	0.0001	0.0001	0.0001	0.0001	0.0001

In the moment of the fourth cut, different to the second, among the biofertlized treatments without the addition of manure, the frequency and intensity of the colonization and the number of spores in the rhizosphere were significantly higher with the application of 70 and 100 kg ha^-1 per year of N, than with the dose of 0 kg ha^-1 of N. Therefore, the highest values of these variables were also reached in the treatments where the biofertilization and the addition of cattle manure was combined, alone or with nitrogen fertilization, except where the higher dose of N was applied.

It has to highlight that, during this cycle, the plants growth in the rainy season and, therefore, the nitrogen fertilizer was applied, which did not happen during the second cut, whose plats growth in the dry season and it was not possible the application of N. These could explain the direct effect of the nitrogen fertilization, combine with the application of the biofertilizers on the increase of the fungi structures.

It has been showed that the availability of nutrients in the soil control the growth of intra and extraradical hyphae of the AMF. In this way, when the plants are inoculated with effective AMF strains, the fungi structures can increase in presence of moderate amounts of nutrients and reduce with the application of dose that exceed the needs of the inoculated crops, since the delivery of recourses from the soil to the host plant through the AMF loss importance (Liu et al. 2019Liu, J., Zhang, J., Li, D., Xu, C. & Xiang, X. 2020. Differential responses of arbuscular mycorrhizal fungal communities to mineral and organic fertilization. Microbiology Open, 9(1): e00920, ISSN: 2045-8827. https://doi.org/10.1002/mbo3.920.). This could explain the increase of the frequency, intensity of colonization and the number of spores in the rhizosphere that was observed in both cuts with the application of biofertilizers and manure, as well as their decrease in the treatment where the biofertilizers and organic fertilizer were combined with the highest dose of nitrogen.

The results also prove the effectiveness of the use of canavalia as proceeding crop and way for the production of mycorrhizal propagules in the soil for the inoculation of successor crops (Rivera et al. 2020Rivera, R., Martín, G.M., Simó, J., Pentón, G., García, M., Ramírez, J., González, P.J., Joao, J.P., Ojeda, L.J., Tamayo, Y. & Bustamante, C. 2020. Benefits of joint management of green manure and mycorrhizal inoculants in crop production. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 23: 97, ISSN: 1870-0462. https://doi.org/10.56369/tsaes.3294., Simó et al. 2020Simó, J., Rivera, R., Ruiz, L. & Martín, G. 2020. The integration of AMF inoculants, green manure and organo-mineral fertilization, in banana plantations on Calcic Haplic Phaeozems. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 23(1): 08, ISSN: 1870-0462. http://dx.doi.org/10.56369/tsaes.2882. and Méndez et al. 2022Méndez, S., González, P.J., Reyes, R. & Ramírez, J.F. 2022. Biofertilization with Azospirillum brasilense and Rhizoglomus irregulare in Tithonia diversifolia (Hemsl.). Pastos y Forrajes, 45: 1-8, ISSN: 2078-8452.) and the effectiveness of the inoculation with R. irregulare and A brasilense in the increase of mycorrhizal structures of tithonia (Méndez et al. 2022Méndez, S., González, P.J., Reyes, R. & Ramírez, J.F. 2022. Biofertilization with Azospirillum brasilense and Rhizoglomus irregulare in Tithonia diversifolia (Hemsl.). Pastos y Forrajes, 45: 1-8, ISSN: 2078-8452.).

In the moment of the second as in the fourth cut there was significant effect of the treatments in the concentrations of N on the biomass of the aerial part (table 6). In the second one, among the non inoculated treatments there were not differences between them and showed the lowest values in relation to the rest. With the biofertilized were reached higher concentrations of N, but the highest values were obtained when they were combined with the application of manure and the doses of 0 and 70 kg ha^-1 of N.

Table 6. Effect of the nitrogen fertilization, biofertilization and cattle manure on the concentrations of N, P and K in the biomass of Tithonia aerial part

Treatments			Second cut, February 2019			Fourth cut, July 2020
N, kg ha^-1	Cattle manure, t ha^-1	Biofertilization
			N	P	K	N	P	K
			g kg^-1
0	0	NB	23.1^c	2.6	21.5	22.1^e	2.1	17.9
70	0	NB	22.8^c	2.4	22.1	24.5^d	2.3	18.3
100	0	NB	23.5^c	2.6	21.7	26.9^c	2.1	17.5
0	0	B	27.8^b	2.5	22.3	26.7^c	2.0	18.1
70	0	B	28.2^b	2.4	22.8	30.3^b	2.3	16.9
100	0	B	29.3^b	2.6	21.9	29.5^b	2.1	18.1
0	25	B	31.2^a	2.4	22.7	33.3^a	2.3	17.9
70	25	B	31.3^a	2.5	22.3	32.9^a	2.0	16.3
100	25	B	27.5^b	2.6	21.8	30.1^b	2.3	18.7
SE±			0.4	0.2	0.3	0.4	0.2	0.3
P			0.0001	0.335	0.418	0.0001	0.382	0.402

In the moment of the fourth cut, different to the previous, between the non biofertilized treatments there was increase of the N concentrations in the biomass of the aerial part with the increase of the nutrient dose, as direct consequence of the nitrogen fertilization applied during this cycle. However, with the biofertilization and the applications of 70 and 100 kg ha^-1 of N highest values were reached. Therefore, the higher concentrations of N were obtained with the application of manure and the biofertilizers, except where the highest dose of this nutrient was applied.

The treatments did not have effects on the concentrations of P and K of the aerial biomass, which proved that the high contents of both elements in the soil at beginning of the experiment were sufficient for the crop. In fact, this criterion was taking into account for not introduce phosphoric and potassium fertilizers in the fertilization plan.

The effect of the nitrogen fertilization on the increase of the N concentrations in the biomass of the aerial part of Tithonia has being mentioned by Botero Londoño et al. (2019)Botero Londoño, J.M., Gómez Carabali, M. & Botero Londoño, M.A. 2019. Nutrient absorption in Tithonia diversifolia. Universitas Scientiarum, 24(1): 33-48, ISSN: 2027-1352. https://doi.org/10.11144/Javeriana.SC24-1.nait. and Astúa et al. (2020)Astúa M., Rojas, A. & Campos C.M. 2020. Extracción de nutrientes del botón de oro (Tithonia diversifolia) ecotipo INTA-Quepos a tres edades de rebrote con tres niveles de fertilización nitrogenada. Nutrición Animal Tropical, 14(2): 113-130, ISSN: 2215-3527. https://doi.org/10.15517/nat.v14i2.44682.; whose attribute it to the high demand of this nutrient, which cannot generally be cover from their contents in the soil, when it is expect to reach a high forage production.

However, the results of this study showed that with the biofertilization with R. irregulare and A. brasilense and the cattle manure, without additional applications of N, the plants are better supplied of this element than with the application of the nitrogen fertilizer. In fact, the addition of 100 kg ha^-1 of N, combined with the biofertilizers and the addition of manure, dressed the N concentrations. This could be consequence of the decrease of the effectiveness of biofertilization, as it was showed when evaluating the effect of treatments on the fungi variables. That is, to the positive effect of the biofertilizers on the nitrogen nutrition, was added the improvement of their effectiveness by the addition of manure and the N contribution of the organic fertilizer. This guarantee that the plants were better supplied with this nutrient than with applied doses of nitrogen fertilizer.

The treatments had a significant effect on the forage production (table 7). In the cuts made on November, 2019 and July, 2020, whose plants growth in the rainy season and received the direct effects of the nitrogen fertilization, among the treatment that only received N it was recorded increase of the DM yields with the increase of the doses, until reaching the highest values with the annual application of 100 kg ha^-1 of N during the year (50 kg ha^-1 in one and other cut).

Table 7. Effect of the nitrogen fertilization, biofertilization and cattle manure on the yield (t ha^-1 DM) of Tithonia forage per cut and the accumulated during the year

Treatments			t DM/ha
N, kg ha^-1 year	Cattle manure, t ha^-1	Biofertilization	First cut, November 2019	Second cut, February 2020	Third cut, May 2020	Fourth cut, July 2020	Accumulated, Nov 2019-July 2020
0	0	NB	3.89^e	3.25^c	2.97^c	4.13^e	14.24^e
70	0	NB	4.64^d	3.33^c	3.11^c	4.83^d	15.91^d
100	0	NB	5.38^c	3.41^c	3.07^c	5.67^c	17.53^c
0	0	B	4.55^d	4.15^b	3.93^b	4.92^d	17.61^c
70	0	B	6.52^b	4.31^b	3.89^b	6.45^b	21.22^b
100	0	B	6.41^b	4.23^b	3.78^b	6.51^b	20.93^b
0	25	B	7.13^a	4.89^a	4.51^a	7.63^a	23.83^a
70	25	B	7.21^a	4.83^a	4.63^a	7.23^a	23.90^a
100	25	B	6.37^b	4.1^b	3.46^b	6.31^b	20.24^b
SE±			0.202	0.181	0.194	0.221	0.415
P			0.0001	0.0001	0.0001	0.0001	0.0000

In both cuts, in the treatments which were biofertilized with A. brasilense and R. irregular without the addition of manure, was only necessary to apply 70 kg ha^-1 of N per year to reach biomass yields, even higher to those obtained with the higher dose of N without biofertilizers. Therefore, in the rest of cuts, the yields reached with the jointly application of biofertlizers were higher with respect to the treatments that only receive N. But when the biofertilizers were jointly applied with the manure, the N applications were not only unnecessary, so they reached yields higher to those recorded with the biofertlizers, alone or with the nitrogen fertilization.

A more clear perception of the effect of treatments on the biomass production was observed in the accumulated yield, where it can state that when it was only applied nitrogen fertilization, the highest response was obtained with 100 kg ha^-1 of N. While, with the biofertilization, without the N addition, the biomass production reached values similar to those that were obtained with the higher dose of this nutrient. However, in presence of biofertilizers, the highest yields were reached with the applications of 70 and 100 ha^-1 of N. When combining the biofertilizers with manure were obtained the maximum forage yields without need to apply N, it was observed decrease with the addition of 100 kg ha^-1 of this nutrient.

The effect of fertilization on the forage production of Tithonia has being mentioned by several researchers. All coincide when explain that the highest yields were reached with a supply of high doses of nutrients (Ramírez 2018Ramírez, R.C. 2018. Extracción de nutrientes y productividad del botón de oro (Titonia diversifolia) con varias dosis de fertilización nitrogenada. Inter Sedes, 19(39): 172-187, ISSN: 2215-2458. http://dx.doi.org/10.15517/isucr.v19i39.34076. and Dos Santos et al. 2021Dos Santos, A., Santos, M., da Silva, L.D., dos Santos, J.B., Ferreira, E.A. & Tuffi, L.D. 2021. Effects of irrigation and nitrogen fertilization rates on yield, agronomic efficiency and morphophysiology in Tithonia diversifolia. Agricultural Water Management, 248: 106782, ISSN: 1873-2283. https://doi.org/10.1016/j.agwat.2021.106782.). Regarding the biofertilization, different authors has recorded increase in the forage production. Hakim et al. (2014)Hakim, N., Alfina, R., Agustian, Hermansah & Yulnafatmawita. 2014. Bacterial inoculants to increase the biomass and nutrient uptake of Tithonia cultivated as hedgerow plants in Ultisols. Malaysian Journal of Soil Science, 18: 115-123, ISSN: 1394-7990. reported them with the combine application of solubilized bacteria of phosphorous and Azospirillum.Murillo et al. (2020)Murillo, F., Vivas, W.F., González, C.E., Bonilla, M.J., Moreira, H. O. & Solórzano, L.J. 2020. Eficiencia simbiótica de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) en el botón de oro (Tithonia diversifolia). Pro Sciences: Revista de Producción, Ciencias e Investigación, 4(33): 12-19, ISSN: 2588-1000. https://doi.org/10.29018/issn.2588-1000vol4iss33.2020pp12-19. reported with the inoculation of AMF strains Claroideoglomus etunicatun and Scutellospora calospora.

It was interest that with the combine application of biofertilizers and cattle manure has been reached the highest forage yields, without applying nitrogen fertilizer. Several aspects seem to explain this performance. The first one can be related with the increase of the biofertilization effectiveness in presence of cattle manure. It has being showed that the biological fixation of nitrogen through the simple inoculation with A. brasilense can contribute up to 54 kg de N ha^-1 year^-1 (Hungria et al. 2016Hungria, M., Nogueira, M.A. & Araujo, R.S. 2016. Inoculation of Brachiaria spp. with the plant growth-promoting bacterium Azospirillum brasilense: An environment-friendly component in the reclamation of degraded pastures in the tropics. Agriculture, Ecosystems & Environment, 221: 125-131, ISSN: 1873-2305. http://dx.doi.org/10.1016/j.agee.2016.01.024. and Aguirre et al. 2020Aguirre, P.F., Giacomini, S.J., Olivo, C.J., Bratz, V.F., Quatrin, M.P. & Schaefer, G.L. 2020. Biological nitrogen fixation and urea-N recovery in 'Coastcross-1' pasture treated with Azospirillum brasilense. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 55: e01242, ISSN: 1678-3921. https://doi.org/10.1590/S1678-3921.pab2020.v55.01242.). Also, the biological fixation of N as the effectiveness of the inoculation with AMF, can be potentiate through the contribution of C and other nutrients and the increase of the microbial activity in the soil, that cause the addition of organic fertilizers (Ren et al. 2021Ren, J., Liu, X., Yang, W., Yang, X., Li, W., Xia, Q., Li, J., Gao, Z. & Yang, Z. 2021. Rhizosphere soil properties, microbial community, and enzyme activities: Short-term responses to partial substitution of chemical fertilizer with organic manure. Journal of Environmental Management, 299: 113650, ISSN: 1095-8630. https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2021.113650.). In fact, Aguirre et al. (2020)Aguirre, P.F., Giacomini, S.J., Olivo, C.J., Bratz, V.F., Quatrin, M.P. & Schaefer, G.L. 2020. Biological nitrogen fixation and urea-N recovery in 'Coastcross-1' pasture treated with Azospirillum brasilense. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 55: e01242, ISSN: 1678-3921. https://doi.org/10.1590/S1678-3921.pab2020.v55.01242. find in perl sorghum increase of the mycorrhizal colonization and decrease of 50 % of the cattle manure dose, when their application was combine with the inoculation with A. brasilense and G. mosseae.

It is also to highlight the positive effect that the AMF exert in cooperation with other microorganisms of the soil, in terms to the OM mineralization and consequently, the absorption of N and other nutrients derived from this process (Jiang et al. 2021Jiang, Sh., An, X., Shao, Y., Kang, Y., Chen, T., Mei, X., Dong, C., Xu, Y. & Shen, Q. 2021. Responses of arbuscular mycorrhizal fungi occurrence to organic fertilizer: A meta‑analysis of field studies. Plant and Soil, 469(1-2): 89-105, ISSN: 1573-5036. https://doi.org/10.1007/s11104-021-05153-y.). If it is added the contribution of the manure nutrients and their possible effects on the improvement of the physical properties of the soil (Sisouvanh et al. 2021Sisouvanh, P., Trelo-ges, V., Isarangkool Na Ayutthaya, S., Pierret, A., Nunan, N., Silvera, N., Xayyathip, K. & Hartmann, C. 2021. Can organic amendments improve soil physical characteristics and increase maize performances in contrasting soil water regimes?. Agriculture, 11: 132, ISSN: 2077-0472. https://doi.org/10.3390/agriculture11020132.) it can ensure the high effect of the join addition of the organic fertilizer and the biofertilizers on the Tithonia yields with respect to the biofertilization, as well as the in the reduction of applying complementary doses of nitrogen fertilizer, at least during the first year of their cultivation. The decrease of yields obtained with the application of 100 kg ha^-1 of N in presence of the biofertilizers and manure and the reduction of the fungi variables observed in this treatments reaffirms the decrease of the biofertilization activity face a N dose that, in this case, was excessive for the Tithonia biofertlized and fertilized with manure during the period in which the experiment was carried out.

When evaluating the effect of the treatments on the extractions of the primary macronutrients (N, P and K) with biomass of the aerial part during the period in which the experiment was performed (table 8), it was observed increase of the three elements with the increase of the nitrogen fertilization without biofertilizers and manure. In the biofertilized treatments, the extractions were higher, above all when they were combined with the doses of 70 and 100 kg ha^-1 of N. But the highest values were obtained with the combine application of bifertilizers and manure, except when N at a rate of 100 kg ha^-1was added.

Table 8. Effects of the nitrogen fertilization, biofertilization and the application of cattle manure on the extractions of N, P and K with the biomass of Tithonia aerial part

Treatments
N, kg ha^-1	Cattle manure, t ha^-1	Biofertilization	N, kg ha^-1	P, kg ha^-1	K, kg ha^-1
0	0	NB	321.8^f	32.8^d	280.5^e
70	0	NB	376.3^e	36.6^c	321.4^d
100	0	NB	441.8^d	40.3^b	343.7^c
0	0	B	479.6^c	38.7^c	355.5^c
70	0	B	619.0^b	48.8^b	420.7^b
100	0	B	615.3^b	47.4^b	418.6^b
0	25	B	768.5^a	54.8^a	483.7^a
70	25	B	767.9^a	52.6^a	471.3^a
100	25	B	579.1^b	50.0^ab	421.8^b
SE±			6.9	1.2	5.7
P			0.0001	0.0001	0.0001

Quantitatively, the extractions fallow the order N>K>P and coincide with those find by Botero Londoño et al. (2019)Botero Londoño, J.M., Gómez Carabali, M. & Botero Londoño, M.A. 2019. Nutrient absorption in Tithonia diversifolia. Universitas Scientiarum, 24(1): 33-48, ISSN: 2027-1352. https://doi.org/10.11144/Javeriana.SC24-1.nait. and Astúa et al. (2020)Astúa M., Rojas, A. & Campos C.M. 2020. Extracción de nutrientes del botón de oro (Tithonia diversifolia) ecotipo INTA-Quepos a tres edades de rebrote con tres niveles de fertilización nitrogenada. Nutrición Animal Tropical, 14(2): 113-130, ISSN: 2215-3527. https://doi.org/10.15517/nat.v14i2.44682.. The first authors also find extraction levels up to 800, 140 and 462 kg ha^-1 of N, P and K with plantation densities of 1 m² per plant and applications of 25, 12 and 11 kg per plant of N, P₂O₅ and K₂O.

Although the exportation levels of nutrients with the Tithonia biomass depends on the soil fertility, fertilizers application, plantation distance and varieties, among other factors. The obtained results by the mentioned authors and also those from this study reaffirm that the crop is highly nutrients extractor from the soil. In addition, despite their rusticity and few edaphic requirements, the fertilization is vital, not only to make higher and to support the forage yields in the time, so to maintain the soil fertility. This involve, especially when it is submitted to frequently cuts for forage production, the need of monitoring the nutrients dynamic in the soil and the exportations of these ones with the biomass and yields, with the purpose of making the appropriate corrections to maintain the yields and to avoid the soil exhaustion.

Introducción

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El interés en la utilización de Tithonia diversifolia como recurso forrajero ha aumentado en los últimos años, lo que responde a su alta producción de biomasa, rápida recuperación después del corte y elevado valor nutricional que supera al de otras especies forrajeras tropicales (Ramírez 2018Ramírez, R.C. 2018. Extracción de nutrientes y productividad del botón de oro (Titonia diversifolia) con varias dosis de fertilización nitrogenada. Inter Sedes, 19(39): 172-187, ISSN: 2215-2458. http://dx.doi.org/10.15517/isucr.v19i39.34076. y Villegas et al. 2020Villegas, S., Maldonado, H.G., Montes, E., Pedroza, S.I., Salinas, T., Santiago, E.J. & Alejos, J.I. 2020. Use of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray in the diet of growing lambs. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, 72 (5): 1929-1935, ISSN: 1678-4162.). Sin embargo, por su capacidad para extraer cantidades importantes de nutrientes, cuando se somete a cortes frecuentes para la producción de forraje, Tithonia diversifolia precisa de una adecuada fertilización para mantener su productividad y conservar la fertilidad del suelo (Botero Londoño et al. 2019Botero Londoño, J.M., Gómez Carabali, M. & Botero Londoño, M.A. 2019. Nutrient absorption in Tithonia diversifolia. Universitas Scientiarum, 24(1): 33-48, ISSN: 2027-1352. https://doi.org/10.11144/Javeriana.SC24-1.nait.).

Los altos precios de los fertilizantes minerales y la necesidad de fomentar una ganadería amigable con el medio ambiente sugieren la búsqueda de estrategias de fertilización que garanticen la nutrición adecuada de los cultivos forrajeros, disminuyan el uso de insumos externos y, a la vez, aseguren la protección de los recursos naturales. El estiércol vacuno es el residuo orgánico más abundante en los agroecosistemas ganaderos, y su uso para la fertilización de estos cultivos constituye una alternativa económica y ecológicamente viable porque contribuye al reciclaje de parte de los nutrientes extraídos con la biomasa consumida por parte del ganado, así como a la reducción de la demanda de fertilizantes minerales y a la mejora de la fertilidad del suelo (Jiang et al. 2021Jiang, Sh., An, X., Shao, Y., Kang, Y., Chen, T., Mei, X., Dong, C., Xu, Y. & Shen, Q. 2021. Responses of arbuscular mycorrhizal fungi occurrence to organic fertilizer: A meta‑analysis of field studies. Plant and Soil, 469(1-2): 89-105, ISSN: 1573-5036. https://doi.org/10.1007/s11104-021-05153-y.).

Últimamente, también se ha prestado mucha atención a la inclusión de los biofertilizantes en los sistemas de fertilización de las plantas forrajeras por su efecto directo en la mejora de las propiedades biológicas de los suelos, en el aumento de la productividad y en el valor nutritivo de la biomasa, así como en la reducción del uso de los fertilizantes sintéticos (Guimarães et al. 2022Guimarães, G.S., Rondina, A.B.L., Santos, M.S., Nogueira, M.A. & Hungria, M. 2022. Pointing Out Opportunities to Increase Grassland Pastures Productivity via Microbial Inoculants: Attending the Society’s Demands for Meat Production with Sustainability. Agronomy, 12: 1748, ISSN: 2073-4395. https://doi.org/10.3390/agronomy12081748.). Entre los microorganismos utilizados como biofertilizantes se encuentra la bacteria asociativa Azospirillum brasilense, capaz de fijar nitrógeno atmosférico y mejorar la productividad y calidad de las cosechas, además de aportar otros beneficios como la producción de fitohormonas, la solubilización de fosfatos y la protección de las plantas contra estreses abióticos (Leite et al. 2019Leite, R.C., Santos A.C., Santos, J.G.D., Leite, R.C., Oliveira, L.B.T. & Hungria M. 2019. Mitigation of mombasa grass (Megathyrsus maximus) dependence on nitrogen fertilization as a function of inoculation with Azospirillum brasilense. Revista Brasileira de Ciência do Solo, 43: e0180234, ISSN: 1806-9657. https://doi.org/10.1590/18069657rbcs20180234.).

Asimismo, la biofertilización con hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA), cuyas estructuras aumentan el volumen de suelo que exploran las raíces y facilitan la absorción de los nutrientes y el agua, entre otros beneficios, ha mostrado su efectividad en diferentes cultivos agrícolas (Chandrasekaran 2020Chandrasekaran, A. 2020. A meta-analytical approach on arbuscular mycorrhizal fungi inoculation efficiency on plant growth and nutrient uptake. Agriculture, 10: 370, ISSN: 2077-0472. https://doi.org/10.3390/agriculture10090370.). De hecho, en las raíces de Tithonia se ha comprobado la presencia de un vasto grupo de especies de HMA y su contribución a la absorción de formas no disponibles de fósforo en el suelo (Scrase et al. 2019Scrase. F.M., Sinclair, F.L., Farrar, J.F., Pavinato, F.P. & Jones, D.L. 2019. Mycorrhizas improve the absorption of non-available phosphorus by the green manure Tithonia diversifolia in poor soils. Rhizosphere, 9: 27-33, ISSN: 2452-2198. https://doi.org/10.1016/j.rhisph.2018.11.001.).

Aunque se conocen los beneficios de la fertilización orgánica (Reis et al. 2018Reis, M.M., Tuffi, L.D., Pegoraro, R.F, Santos, M.V., Colen, F., Colen, F., Montes, W.G., Moura, R.R., da Cruz, L. R. & Oliveira, F. 2018. Productive and nutritional aspects of Tithonia diversifolia fertilized with biofertilizer and irrigated. Journal of Agricultural Science, 10(11): 367-379, ISSN: 1916-9760. https://doi.org/10.5539/jas.v10n11p367.) y el efecto favorable de la doble inoculación con A. brasilense y HMA en el aumento de la productividad y el valor nutritivo de Tithonia (Méndez et al. 2022Méndez, S., González, P.J., Reyes, R. & Ramírez, J.F. 2022. Biofertilization with Azospirillum brasilense and Rhizoglomus irregulare in Tithonia diversifolia (Hemsl.). Pastos y Forrajes, 45: 1-8, ISSN: 2078-8452.), los estudios dirigidos al diseño de estrategias de fertilización basadas en el manejo integrado de abonos orgánicos, fertilizantes minerales y ambos microorganismos son escasos, a pesar de sus posibles ventajas para mejorar los rendimientos, reducir los insumos externos y conservar la fertilidad del suelo.

Al considerar estas premisas, se realizó este estudio para evaluar los efectos del manejo integrado de la fertilización, basada en biofertilizantes, estiércol vacuno y fertilizante nitrogenado, en indicadores de la fertilidad del suelo y la producción de forraje de T. diversifolia.

Materiales y Métodos

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Condiciones experimentales

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El experimento se realizó en la vaquería típica 23 de la Unidad Básica de Producción Cooperativa (UBPC) "Juan Oramas", ubicada en el municipio de Guanabacoa, provincia La Habana, Cuba, a los 23^o08’ de latitud norte y a los 82º11’ de longitud oeste, sobre un suelo cambisol cálcico, según la Base Referencial Mundial del Recurso Suelo (IUSS 2015IUSS Working Group WRB, 2015. Base referencial mundial del recurso suelo 2014, Actualización 2015. Sistema internacional de clasificación de suelos para la nomenclatura de suelos y la creación de leyendas de mapas de suelos. Informes sobre recursos mundiales de suelos 106. FAO, Roma.). Sus principales características químicas se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Características químicas del suelo de los experimentos (profundidad: 0-20 cm)

pH H₂O	MO, %	P,	Ca²⁺	Mg²⁺	Na,⁺	K⁺	CIB
pH H₂O	MO, %	mg kg^-1	cmol_c kg^-1
7.7	4.50	70	49.5	4.8	0.25	0.57	54.9
(7.5-7.8)	(4.25-4.76)	(65-76)	(47.3-51.7)	(4.1-5.2)	(0.22-0.28)	(0.51-0.63)	(53.7-56.4)

MO: materia orgánica. CIB: capacidad de intercambio de bases. Valores entre paréntesis indican intervalos de confianza de las medias (α=0.05).

El suelo del sitio experimental posee altos contenidos de P asimilable, pH alcalino, contenido medio de MO, alta capacidad de intercambio de bases (CIB) y altos contenidos de K intercambiable (Paneque y Calaña 2001Paneque, V.M. & Calaña, J.M. 2001. La fertilización de los cultivos. Aspectos teórico prácticos para su recomendación. San José de las Lajas, Cuba: Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas. p. 28. ).

Durante el período experimental (mayo 2019-junio 2020), la precipitación total fue de 1705 mm, 83 % ocurrió durante los meses correspondientes a las épocas de lluvia (mayo-octubre de 2019 y mayo-junio de 2020), según se muestra en la figura 1.

Figura 1. Distribución de las precipitaciones durante el período de ejecución del experimento (datos tomados en el área experimental)

Tratamientos y diseño experimental

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Se evaluaron nueve tratamientos, conformados por las aplicaciones de 0, 70 y 100 kg N ha^-1; 0, 70 y 100 kg N ha^-1 más la coinoculación con Azospirillum brasilense y Rhizoglomus irregulare, y 0, 70 y 100 kg N ha^-1 más la coinoculación con A. Brasilense y R. irregulare y la aplicación de 25 tha^-1 de estiércol vacuno en un diseño de bloques al azar con cuatro réplicas. Las parcelas constituyeron la unidad experimental y tenían superficie total de 24 m² y área de cálculo de 16 m².

Inoculantes utilizados

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Para la biofertilización con HMA se utilizó un inoculante que contenía la cepa INCAM-11 de la especie R. irregulare (Sieverding et al. 2014Sieverding, E., Silva, G.A. da, Berndt, R. & Oehl, F. 2014. Rhizoglomus, a new genus of the Glomeraceae. Mycotaxon, 129 (2): 373-386, ISSN: 2154-8889. https://doi.org/10.5248/129.373.). El inoculante procedía del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) y se multiplicó previamente en un sustrato arcilloso esterilizado en autoclave a 120 °C por una hora durante tres días, con el uso de Urochloa decumbens vc. Basilisk como planta hospedera. Contenía 50 esporas por gramo de inoculante sólido, así como abundantes fragmentos de raicillas de la planta hospedera. Para la biofertilización con A. brasilense, se utilizó el producto comercial Nitrofix^®, procedente del Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA), que contenía la cepa 8I, con concentración de 10⁹ UFC mL^-1.

Preparación del suelo, siembra, aplicación de los inoculantes y fertilización

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El suelo se preparó mediante labores de roturación (arado), grada, cruce (arado) y grada, a intervalos aproximados de 25 d entre cada una. El estiércol vacuno se aplicó sobre la superficie de las parcelas y se incorporó al suelo con la segunda labor de aradura. Este procedía de las áreas estabuladas de la vaquería y tenía un tiempo de tres meses de deposición en el estercolero. Sus características químicas y contenido de humedad al momento de su aplicación se presentan en la tabla 2.

Tabla 2. Características químicas (base seca) y contenido de humedad del estiércol vacuno como abono orgánico en el experimento

MO, %	N, %	Relación C/N	P, %	K, %	Ca, %	Mg, %	pH	Humedad, %
61.7	2.25	16.6	0.65	1.83	2.92	0.71	7.2	52.7
(61.2-62.2)	(2.22-2.28)	(14.7-18.5)	(0.63-0.67)	(1.80-1.86)	(2.87-2.97)	0.69-0.73)	(7.0-7.4)	(52.1-53.3)

Promedio de diez muestras tomadas en el momento de la aplicación del estiércol. Valores entre paréntesis muestran el intervalo de confianza de las medias (α = 0.05)

En mayo de 2019 todos los tratamientos se sembraron de canavalia (Canavalia ensiformis) como vía para reproducir en el suelo en aquellos que conllevaron la inoculación con R. irregulare, cantidades suficientes de propágulos micorrízicos para la posterior inoculación de la Tithonia. Se siguió el método de aplicación de inoculantes micorrízicos para este cultivo, utilizado por Méndez et al. (2022)Méndez, S., González, P.J., Reyes, R. & Ramírez, J.F. 2022. Biofertilization with Azospirillum brasilense and Rhizoglomus irregulare in Tithonia diversifolia (Hemsl.). Pastos y Forrajes, 45: 1-8, ISSN: 2078-8452..

La canavalia se sembró a distancias de 50 cm entre surcos y 25 cm entre plantas, con densidad de 100 kg ha^-1 de semillas. En los tratamientos a inocular con R. irregulare, las semillas se recubrieron con una cantidad de inoculante micorrízico equivalente al 10 % de su masa. Para el recubrimiento, las semillas se sumergieron en una pasta fluida, elaborada mediante la mezcla del inoculante micorrízico sólido y agua, en proporción 1:0.6 m/v. Posteriormente, se secaron a la sombra y se sembraron.

La canavalia se cortó a los 60 d después de la siembra y su biomasa aérea se retiró del campo para la alimentación de los animales. La tabla 3 muestra la cantidad de esporas de HMA que quedaron en el suelo después del corte de la canavalia y al momento de la plantación de Tithonia.

Tabla 3. Cantidades de esporas de HMA que quedaron en el suelo en cada tratamiento después del corte de la canavalia.

No	N, kg ha^-1	Estiércol vacuno, t ha^-1	Biofertilización	Número de esporas/50g
1	0	0	NB	133 (118-148)
2	70	0	NB	145 (128-162)
3	100	0	NB	138 (125-151)
4	0	0	B	520 (501-539)
5	70	0	B	492 (459-525)
6	100	0	B	518 (483-553)
7	0	25	B	526 (494-558)
8	0	25	B	499 (472-523)
9	70	25	B	519 (486-552)

NB: no biofertilizado. B: biofertilizado con Azospirillum brasilense y Rhizoglumus irregulare. Valores entre paréntesis indican intervalos de confianza (α=0.05)

Después del corte de la canavalia, se surcó nuevamente y se procedió a la plantación de la Tithonia mediante el uso de propágulos vegetativos de aproximadamente 30 cm de longitud. Se tomaron de la parte superior y media de los tallos de un campo cultivado de esta especie, muy próximo al área experimental. Los propágulos se plantaron a 1.0 m entre surcos y 0.5 m entre plantas, para una densidad de 20000 propágulos ha^-1.

La inoculación con A. brasilense se realizó a los 15 d después de la brotación de la Tithonia. Para ello se preparó una mezcla de inóculo líquido y agua (1:10 v/v) y se aplicó al suelo muy próximo a los surcos mediante una mochila manual, a razón de 20 L ha^-1 del producto comercial.

El fertilizante nitrogenado se usó según las dosis descritas en los tratamientos, fraccionado en dos momentos: 50 % a los 30 d después de la plantación y el resto, después del tercer corte, ambos coincidieron con períodos lluviosos. Para la aplicación, se abrieron con una azada pequeños surcos de 10 cm de profundidad, a 10 cm de las hileras de las plantas y se taparon después de colocado el fertilizante. Como portador del fertilizante nitrogenado se utilizó la urea. No se aplicó fertilizante fosfórico ni potásico porque se consideró que los altos contenidos de ambos nutrientes en el suelo (tabla 1) eran suficientes para el cultivo. El experimento se condujo en condiciones de secano.

Muestreos y evaluaciones

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Se realizaron cuatro cortes. El primero a los 120 d después de la plantación (noviembre de 2019), y el resto en febrero, mayo y julio de 2020 a altura de 30 cm de la superficie del suelo. En cada corte se pesó la masa fresca de la parte aérea correspondiente al área de cálculo de las parcelas. De cada tratamiento se tomaron tres submuestras de la masa fresca de la parte aérea y se homogeneizaron para formar una muestra compuesta de 200 g. Las submuestras se llevaron a una estufa de circulación de aire a 70 ºC durante 72 h para determinar el porcentaje de masa seca (MS) y estimar el rendimiento de MS. En el segundo y cuarto corte, se determinaron las concentraciones (g kg^-1 de MS) de N, P y K en la biomasa de la parte aérea, según el manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos (Paneque et al. 2011Paneque, V.M., Calaña, J. M., Calderón, M., Borges, Y., Hernández, T. & Caruncho, M. 2011. Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos. Mayabeque, Cuba: Ediciones INCA, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas.).

Se calculó la extracción de N, P y K en la biomasa de la parte aérea. Para ello se tomaron los valores promedio de las concentraciones de estos nutrientes en el momento del segundo y cuarto corte y el rendimiento acumulado de la biomasa aérea (suma de los cuatro cortes). Se utilizó la fórmula siguiente:

Extracción de N, P y K (kg ha^-1) = [rendimiento acumulado de MS, kg ha^-1 x concentración del elemento en la MS de la parte aérea, g kg^-1] / 1000

En el momento de segundo y cuarto corte, enmarcados en el período lluvioso y poco lluvioso, respectivamente, se tomaron de cada parcela tres submuestras de raíces y de suelo de la rizosfera, a profundidad de 0‒20 cm mediante la utilización de un cilindro metálico de 5 cm de diámetro y 20 cm de altura. Los puntos de muestreo se distribuyeron equidistantes y separados a 10 cm de los surcos. Las submuestras se homogeneizaron para formar una muestra compuesta por parcela, y se extrajo 1 g de raicillas para su tinción y clarificación (Rodríguez et al. 2015Rodríguez, Y., Arias, L., Medina, A., Mujica, Y., Medina, L. Fernández, K. & Mena, A. 2015. Alternativa de la técnica de tinción para determinar la colonización micorrízica. Cultivos Tropicales, 36(2): 18-21, ISSN: 1819-4087.). Se evaluó la frecuencia de colonización micorrízica mediante el método de los interceptos (Giovanetti y Mosse 1980Giovanetti, M. & Mosse, B. 1980. An evaluation of techniques for measuring vesicular arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytologist, 84: 489-500, ISSN: 1469-8137. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.1980.tb04556.x. ), la densidad visual o intensidad de la colonización, de acuerdo con Trouvelot et al. (1986)Trouvelot, A., Kough, J.L. & Gianinazzi-Pearson, V. 1986. Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherche de méthode d’estimation ayant une signification fonctionnelle. Physiological and genetical aspects of mycorrhizae. Proceedings of the 1st Symposium Européen sur les Mycorhizes. París: INRA. p. 217-221, 1986. y el número de esporas en la rizosfera a partir del tamizado y decantado por vía húmeda de dichas estructuras y su observación en microscopio (Herrera et al. 1995Herrera, A., Ferrer, L., Furrazola, E. & Orozco, M.O. 1995. Estrategia de funcionamiento de las micorrizas VA en un bosque tropical. Biodiversidad en Iberoamérica. Ecosistemas, evolución y procesos sociales. En: M. Monasterio, ed. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Subprograma XII, Diversidad Biológica. Mérida, México, 1995.).

En el área donde se ejecutó el experimento, previo a la siembra de la canavalia, se tomaron con una barrena 10 muestras de suelo por el método del zigzag, a profundidad de 0-20 cm para su caracterización química. Después del segundo corte, se tomaron tres submuestras de suelo por parcela a profundidad de 0-20 cm para formar una muestra compuesta y determinar sus contenidos de MO, P asimilable y K intercambiable (Paneque et al. 2011Paneque, V.M., Calaña, J. M., Calderón, M., Borges, Y., Hernández, T. & Caruncho, M. 2011. Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos. Mayabeque, Cuba: Ediciones INCA, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas.).

Análisis estadístico

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Los datos, una vez comprobados la normalidad y homogeneidad de varianzas, se procesaron mediante el análisis de varianza y la prueba de Tukey (P<0.05). En las variables correspondientes a la caracterización química inicial del suelo, y al conteo de esporas HMA (número de esporas/50 g) que quedaron en el suelo después del corte de la canavalia, se utilizó el intervalo de confianza (α=0.05) como estadígrafo de dispersión (Payton et al. 2000Payton, M.E., Miller, A.E. & Raun, W.R. 2000. Testing statistical hypotheses using standard error bars and confidence intervals. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 31(5-6): 547-551, ISSN: 1532-2416. https://doi.org/10.1080/00103620009370458.). En todos los casos se utilizó el programa estadístico SPSS 25 (2017)SPSS. 2017. Statistical Software, Version 25. SPSS Institute, Chicago, Illinois, U.S.A..

Resultados y Discusión

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Se encontró efecto significativo de la adición del estiércol vacuno en los contenidos de MO, P asimilable y K intercambiable del suelo (tabla 4), lo que estuvo en correspondencia con las cantidades de estos elementos aportados por el abono orgánico. De acuerdo con su composición, con cada tonelada de estiércol (en base húmeda) se incorporaron al suelo aproximadamente 290 kg de MO, 3 kg de P y 9 kg de K, y ello repercutió, sin dudas, en el incremento de sus contenidos en el suelo. El estiércol no tuvo efectos en el pH, debido probablemente a la reacción alcalina del suelo y al pH neutral del abono.

Tabla 4. Efecto de la fertilización nitrogenada, la biofertilización y la aplicación de estiércol vacuno en los contenidos de MO, pH, P asimilable y K intercambiable del suelo

Tratamientos			MO, %	pH, H₂O	P, mg kg^-1	K, cmol_c kg^-1
N, kg ha^-1 año	Estiércol vacuno, t ha^-1	Biofertilización	MO, %	pH, H₂O	P, mg kg^-1	K, cmol_c kg^-1
0	0	NB	4.40^b	7.5	62^b	0.57^b
70	0	NB	4.50^b	7.7	65^b	0.62^b
100	0	NB	4.36^b	7.5	61^b	0.52^b
0	0	B	4.62^b	7.6	70^b	0.58^b
70	0	B	4.35^b	7.4	63^b	0.61^b
100	0	B	4.39^b	7.6	67^b	0.53^b
0	25	B	5.46^a	7.7	116^a	1.28^a
70	25	B	5.54^a	7.8	121^a	1.31^a
100	25	B	5.49^a	7.6	118^a	1.26^a
ES±			0.216	0.193	6.211	0.1531
P			0.0001	0.332	0.0001	0.0002

NB: no biofertilizado. B: biofertilizado con Azospirillum brasilense + Rhizoglomus irregulare. Promedios con letras comunes en la misma columna no difieren significativamente, según prueba de Tukey (P<0.05)

Aunque se conocen los beneficios de las aplicaciones del estiércol vacuno en la fertilidad del suelo, su inclusión en los sistemas de fertilización de los cultivos forrajeros continúa hoy siendo una estrategia acertada por los numerosos servicios ambientales que genera en los agroecosistemas ganaderos por su contribución al reciclaje de los nutrientes que se extraen del suelo con la biomasa que consumen los animales, así como por su impacto directo en la reducción del efecto contaminante que origina su disposición incorrecta (Sileshi et al. 2019Sileshi, G.W., Jama, B., Vanlauwe, B., Negassa, W., Harawa, R., Kiwia, A. & Kimani, D. 2019. Nutrient use efficiency and crop yield response to the combined application of cattle manure and inorganic fertilizer in sub-Saharan Africa. Nutrient Cycling in Agroecosystems, 113: 181-199, ISSN: 1385-1314. https://doi.org/10.1007/s10705-019-09974-3.).

En la tabla 5 se presenta el efecto de los tratamientos en las variables fúngicas en el momento del segundo y cuarto cortes. En el segundo, la aplicación conjunta de ambos biofertilizantes, sola o acompañada de N, incrementó la frecuencia e intensidad de la colonización, así como el número de esporas en la rizosfera en relación con los tratamientos no biofertilizados. Sin embargo, estas variables alcanzaron los valores más altos con la aplicación de los biofertilizantes combinados con el estiércol vacuno, excepto donde se adicionó la mayor dosis de N.

Tabla 5. Efecto de la fertilización nitrogenada, la biofertilización y la aplicación de estiércol vacuno en las estructuras fúngicas de titonia en el momento del segundo y cuarto corte

Tratamientos			Segundo corte, febrero 2019		Cuarto corte, julio 2020
N, kgha^-1 año	Estiércol vacuno, t ha^-1	Bio- fertilización	Frecuencia colonización, %	Intensidad colonización, %	Esporas/50 g	Frecuencia colonización, %	Intensidad colonización, %	Esporas/ 50 g
0	0	NB	23.9^c	3.15^c	87^c	33.7^d	3.27^d	125^d
70	0	NB	22.8^c	2.89^c	92^c	34.3^d	2.93^d	132^d
100	0	NB	21.3^c	3.19^c	89^c	33.9^d	3.19^d	129^d
0	0	B	34.7^b	4.63^b	223^b	41.4^c	4.53^c	313^c
70	0	B	33.9^b	4.61^b	225^b	52.7^b	5.55^b	473^b
100	0	B	33.5^b	4.57^b	237^b	51.9^b	5.38^b	451^b
0	25	B	38.3^a	5.91^a	393^a	64.2^a	6.75^a	613^a
70	25	B	39.5^a	6.22^a	418^a	63.8^a	6.97^a	587^a
100	25	B	34.9^b	4.59^b	242^b	40.5^c	4.39^c	309^c
ES±			1.625	0.280	23.51	1.812	0.261	32.55
P			0.0001	0.0001	0.0001	0.0001	0.0001	0.0001

En el momento del cuarto corte, a diferencia del segundo, entre los tratamientos biofertilizados sin la adición de estiércol, la frecuencia e intensidad de la colonización y el número de esporas en la rizosfera, fueron significativamente mayores con las aplicaciones de 70 y 100 kg ha^-1 por año de N, que con la dosis de 0 kg ha^-1 de N. No obstante, los mayores valores de estas variables se alcanzaron también en los tratamientos donde se combinó la biofertilización y la adición de estiércol vacuno, solas o acompañadas de la fertilización nitrogenada, excepto donde se aplicó la mayor dosis de N.

Hay que señalar que, durante este ciclo, las plantas crecieron en el período lluvioso y, por tanto, se aplicó fertilizante nitrogenado, lo que no ocurrió durante el segundo corte, cuyas plantas crecieron en el período poco lluvioso y no fue posible la aplicación de N. Ello pudiera explicar el efecto directo que tuvo la fertilización nitrogenada, combinada con la aplicación de los biofertilizantes en el incremento de las estructuras fúngicas.

Se ha demostrado que la disponibilidad de nutrientes en el suelo controla el crecimiento de las hifas intra y extrarradicales de los HMA. De este modo, cuando las plantas se inoculan con cepas HMA efectivas, las estructuras fúngicas pueden aumentar en presencia de cantidades moderadas de nutrientes y se reducen con la aplicación de dosis que superan las necesidades de los cultivos inoculados, ya que la entrega de recursos del suelo a la planta hospedera a través de los HMA pierde importancia (Liu et al. 2020Liu, J., Zhang, J., Li, D., Xu, C. & Xiang, X. 2020. Differential responses of arbuscular mycorrhizal fungal communities to mineral and organic fertilization. Microbiology Open, 9(1): e00920, ISSN: 2045-8827. https://doi.org/10.1002/mbo3.920.). Esto pudiera explicar el aumento de la frecuencia e intensidad de la colonización y el número de esporas en la rizosfera que se observó en ambos cortes con la aplicación de los biofertilizantes y el estiércol, así como su disminución en el tratamiento donde se combinaron los biofertilizantes y el abono orgánico con la dosis más alta de nitrógeno.

Los resultados también corroboran la efectividad del uso de la canavalia como cultivo precedente y vía para la producción de propágulos micorrízicos en el suelo para la inoculación de cultivos sucesores (Rivera et al. 2020Rivera, R., Martín, G.M., Simó, J., Pentón, G., García, M., Ramírez, J., González, P.J., Joao, J.P., Ojeda, L.J., Tamayo, Y. & Bustamante, C. 2020. Benefits of joint management of green manure and mycorrhizal inoculants in crop production. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 23: 97, ISSN: 1870-0462. https://doi.org/10.56369/tsaes.3294., Simó et al. 2020Simó, J., Rivera, R., Ruiz, L. & Martín, G. 2020. The integration of AMF inoculants, green manure and organo-mineral fertilization, in banana plantations on Calcic Haplic Phaeozems. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 23(1): 08, ISSN: 1870-0462. http://dx.doi.org/10.56369/tsaes.2882. y Méndez et al. 2022Méndez, S., González, P.J., Reyes, R. & Ramírez, J.F. 2022. Biofertilization with Azospirillum brasilense and Rhizoglomus irregulare in Tithonia diversifolia (Hemsl.). Pastos y Forrajes, 45: 1-8, ISSN: 2078-8452.) y la efectividad de la coinoculación con R. irregulare y A brasilense en el aumento de las estructuras micorrízicas de titonia (Méndez et al. 2022Méndez, S., González, P.J., Reyes, R. & Ramírez, J.F. 2022. Biofertilization with Azospirillum brasilense and Rhizoglomus irregulare in Tithonia diversifolia (Hemsl.). Pastos y Forrajes, 45: 1-8, ISSN: 2078-8452.).

En el momento del segundo como en el cuarto corte se encontró efecto significativo de los tratamientos en las concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea (tabla 6). En el segundo, entre los tratamientos no inoculados no se observaron diferencias entre sí y mostraron los valores más bajos en relación con el resto. Con los biofertilizantes se alcanzaron mayores concentraciones de N, pero los valores más altos se obtuvieron cuando se combinaron con la aplicación de estiércol y las dosis de 0 y 70 kg ha^-1 de N.

Tabla 6. Efecto de la fertilización nitrogenada, la biofertilización y el estiércol vacuno en las concentraciones de N, P y K en la biomasa de la parte aérea de Tithonia

Tratamientos			Segundo corte, febrero 2019			Cuarto corte, julio 2020
N, kg ha^-1	Estiércol vacuno, t ha^-1	Biofertilización
			N	P	K	N	P	K
			g kg^-1
0	0	NB	23.1^c	2.6	21.5	22.1^e	2.1	17.9
70	0	NB	22.8^c	2.4	22.1	24.5^d	2.3	18.3
100	0	NB	23.5^c	2.6	21.7	26.9^c	2.1	17.5
0	0	B	27.8^b	2.5	22.3	26.7^c	2.0	18.1
70	0	B	28.2^b	2.4	22.8	30.3^b	2.3	16.9
100	0	B	29.3^b	2.6	21.9	29.5^b	2.1	18.1
0	25	B	31.2^a	2.4	22.7	33.3^a	2.3	17.9
70	25	B	31.3^a	2.5	22.3	32.9^a	2.0	16.3
100	25	B	27.5^b	2.6	21.8	30.1^b	2.3	18.7
ES±			0.411	0.221	0.302	0.418	0.218	0.315
P			0.0001	0.335	0.418	0.0001	0.382	0.402

En momento del cuarto corte, a diferencia del anterior, entre los tratamientos no biofertilizados hubo aumento creciente de las concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea con el incremento de las dosis del nutriente, como consecuencia directa de la fertilización nitrogenada aplicada durante ese ciclo. Sin embargo, con la biofertilización acompañada de las aplicaciones de 70 y 100 kg ha^-1 de N se alcanzaron valores más altos. No obstante, las mayores concentraciones de N se obtuvieron con la aplicación del estiércol y los biofertilizantes, excepto donde se aplicó la dosis más alta de este nutriente.

Los tratamientos no tuvieron efectos en las concentraciones de P y K de la biomasa aérea, lo que corroboró que los altos contenidos de ambos elementos en el suelo al inicio del experimento fueron suficientes para el cultivo. De hecho, este criterio se tuvo en cuenta para no introducir fertilizantes fosfórico ni potásico en los esquemas de fertilización.

El efecto de la fertilización nitrogenada en el aumento de las concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea de Tithonia ha sido abordado por Botero Londoño et al. (2019)Botero Londoño, J.M., Gómez Carabali, M. & Botero Londoño, M.A. 2019. Nutrient absorption in Tithonia diversifolia. Universitas Scientiarum, 24(1): 33-48, ISSN: 2027-1352. https://doi.org/10.11144/Javeriana.SC24-1.nait. y Astúa et al. (2020)Astúa M., Rojas, A. & Campos C.M. 2020. Extracción de nutrientes del botón de oro (Tithonia diversifolia) ecotipo INTA-Quepos a tres edades de rebrote con tres niveles de fertilización nitrogenada. Nutrición Animal Tropical, 14(2): 113-130, ISSN: 2215-3527. https://doi.org/10.15517/nat.v14i2.44682., quienes lo atribuyen a la alta demanda de este nutriente, que generalmente no puede ser cubierta a partir de sus contenidos en el suelo, cuando se pretende alcanzar una alta producción de forraje.

No obstante, los resultados de este trabajo evidenciaron que con la biofertilización conjunta con R. irregulare y A. brasilense más el estiércol vacuno, sin aplicaciones adicionales de N, las plantas quedan mejor abastecidas de este elemento que con la aplicación del fertilizante nitrogenado. De hecho, la adición de 100 kg ha^-1 de N, combinada con los biofertilizantes y la adición de estiércol, disminuyó las concentraciones de N. Esto pudo ser consecuencia de la disminución de la efectividad de la biofertilización, tal como se demostró al evaluar el efecto de los tratamientos en las variables fúngicas. Es decir, al efecto positivo de los biofertilizantes en la nutrición nitrogenada, se sumó la mejora de su efectividad por la adición de estiércol y el aporte de N del abono orgánico. Ello garantizó que las plantas quedaran mejor abastecidas con este nutriente que con las dosis aplicadas de fertilizante nitrogenado.

Los tratamientos tuvieron un efecto significativo en la producción de forraje (tabla 7). En los cortes realizados en noviembre de 2019 y julio de 2020, cuyas plantas crecieron en el período lluvioso y recibieron los efectos directos de la fertilización nitrogenada, entre los tratamientos que sólo recibieron N se registró aumento creciente de los rendimientos de MS con el incremento de las dosis, hasta alcanzar los mayores valores con la aplicación anual de 100 kg ha^-1 de N durante el año (50 kg ha^-1 en uno y otro corte).

Tabla 7. Efecto de la fertilización nitrogenada, la biofertilización y el estiércol vacuno en el rendimiento (t ha^-1 MS) de forraje de Tithonia por corte y el acumulado durante el año

Tratamientos			t MS/ha
N, kg ha^-1 año	Estiércol vacuno, t ha^-1	Biofertilización	Primer corte, noviembre 2019	Segundo corte, febrero 2020	Tercer corte, mayo 2020	Cuarto corte, julio 2020	Acumulado, noviembre 2019-julio 2020
0	0	NB	3.89^e	3.25^c	2.97^c	4.13^e	14.24^e
70	0	NB	4.64^d	3.33^c	3.11^c	4.83^d	15.91^d
100	0	NB	5.38^c	3.41^c	3.07^c	5.67^c	17.53^c
0	0	B	4.55^d	4.15^b	3.93^b	4.92^d	17.61^c
70	0	B	6.52^b	4.31^b	3.89^b	6.45^b	21.22^b
100	0	B	6.41^b	4.23^b	3.78^b	6.51^b	20.93^b
0	25	B	7.13^a	4.89^a	4.51^a	7.63^a	23.83^a
70	25	B	7.21^a	4.83^a	4.63^a	7.23^a	23.90^a
100	25	B	6.37^b	4.10^b	3.46^b	6.31^b	20.24^b
ES±			0.202	0.181	0.194	0.221	0.415
P			0.0001	0.0001	0.0001	0.0001	0.0000

En ambos cortes, en los tratamientos que fueron biofertilizados con A. brasilense y R. irregulare sin la adición de estiércol, sólo fue necesario aplicar 70 kg ha^-1 de N por año para alcanzar rendimientos de biomasa, incluso superiores a los obtenidos con la dosis mayor de N sin biofertilizantes. No obstante, en el resto de los cortes, los rendimientos alcanzados con la aplicación conjunta de los biofertilizantes fueron mayores con respecto a los tratamientos que sólo recibieron N. Pero cuando los biofertilizantes se aplicaron conjuntamente con el estiércol, las aplicaciones de N no solo resultaron innecesarias, sino que alcanzaron rendimientos superiores a los registrados con los biofertilizantes, solos o acompañados de la fertilización nitrogenada.

Una percepción más clara del efecto de los tratamientos en la producción de biomasa se observó en el rendimiento acumulado, donde se pudo constatar que cuando se aplicó solamente fertilizante nitrogenado, la mayor respuesta se obtuvo con 100 kg ha^-1 de N. En tanto, con la biofertilización, sin la adición de N, la producción de biomasa alcanzó valores similares a los que se obtuvieron con la dosis mayor de este nutriente. Sin embargo, en presencia de los biofertilizantes, los mayores rendimientos se alcanzaron con las aplicaciones de 70 y 100 ha^-1 de N. Al combinar los biofertilizantes con el estiércol se obtuvieron los máximos rendimientos de forraje sin necesidad de aplicar N, más bien se observó disminución con la adición de 100 kg ha^-1 de este nutriente.

El efecto de la fertilización en la producción de forraje de Tithonia ha sido abordado por varios investigadores. Todos coinciden al plantear que los mayores rendimientos se alcanzan con un suministro de dosis altas de nutrientes (Ramírez 2018Ramírez, R.C. 2018. Extracción de nutrientes y productividad del botón de oro (Titonia diversifolia) con varias dosis de fertilización nitrogenada. Inter Sedes, 19(39): 172-187, ISSN: 2215-2458. http://dx.doi.org/10.15517/isucr.v19i39.34076. y Dos Santos et al. 2021Dos Santos, A., Santos, M., da Silva, L.D., dos Santos, J.B., Ferreira, E.A. & Tuffi, L.D. 2021. Effects of irrigation and nitrogen fertilization rates on yield, agronomic efficiency and morphophysiology in Tithonia diversifolia. Agricultural Water Management, 248: 106782, ISSN: 1873-2283. https://doi.org/10.1016/j.agwat.2021.106782.). En relación con la biofertilización, distintos autores han registrado incrementos en la producción de forraje. Hakim et al. (2014)Hakim, N., Alfina, R., Agustian, Hermansah & Yulnafatmawita. 2014. Bacterial inoculants to increase the biomass and nutrient uptake of Tithonia cultivated as hedgerow plants in Ultisols. Malaysian Journal of Soil Science, 18: 115-123, ISSN: 1394-7990. los informaron con la aplicación combinada de bacterias solubilizadoras de fósforo y Azospirillum.Murillo et al. (2020)Murillo, F., Vivas, W.F., González, C.E., Bonilla, M.J., Moreira, H. O. & Solórzano, L.J. 2020. Eficiencia simbiótica de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) en el botón de oro (Tithonia diversifolia). Pro Sciences: Revista de Producción, Ciencias e Investigación, 4(33): 12-19, ISSN: 2588-1000. https://doi.org/10.29018/issn.2588-1000vol4iss33.2020pp12-19. dan cuenta de ello con la inoculación de las cepas de HMA Claroideoglomus etunicatun y Scutellospora calospora.

Resultó interesante que con la aplicación combinada de los biofertilizantes y el estiércol vacuno se haya alcanzado los mayores rendimientos de forraje, sin necesidad de aplicar fertilizante nitrogenado. Varios aspectos parecen explicar este comportamiento. El primero puede estar relacionado con el aumento de la efectividad de la biofertilización en presencia del estiércol vacuno. Se ha demostrado que la fijación biológica del nitrógeno a través de la inoculación simple con A. brasilense puede aportar hasta 54 kg de N ha^-1 año^-1 (Hungria et al. 2016Hungria, M., Nogueira, M.A. & Araujo, R.S. 2016. Inoculation of Brachiaria spp. with the plant growth-promoting bacterium Azospirillum brasilense: An environment-friendly component in the reclamation of degraded pastures in the tropics. Agriculture, Ecosystems & Environment, 221: 125-131, ISSN: 1873-2305. http://dx.doi.org/10.1016/j.agee.2016.01.024. y Aguirre et al. 2020Aguirre, P.F., Giacomini, S.J., Olivo, C.J., Bratz, V.F., Quatrin, M.P. & Schaefer, G.L. 2020. Biological nitrogen fixation and urea-N recovery in 'Coastcross-1' pasture treated with Azospirillum brasilense. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 55: e01242, ISSN: 1678-3921. https://doi.org/10.1590/S1678-3921.pab2020.v55.01242.). Además, la fijación biológica de N como la efectividad de la inoculación con HMA, se pueden potenciar a través del aporte de C y otros nutrientes y del incremento de la actividad microbiana en el suelo, que provocan las adiciones de abonos orgánicos (Ren et al. 2021Ren, J., Liu, X., Yang, W., Yang, X., Li, W., Xia, Q., Li, J., Gao, Z. & Yang, Z. 2021. Rhizosphere soil properties, microbial community, and enzyme activities: Short-term responses to partial substitution of chemical fertilizer with organic manure. Journal of Environmental Management, 299: 113650, ISSN: 1095-8630. https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2021.113650.). De hecho, Aguirre et al. (2020)Aguirre, P.F., Giacomini, S.J., Olivo, C.J., Bratz, V.F., Quatrin, M.P. & Schaefer, G.L. 2020. Biological nitrogen fixation and urea-N recovery in 'Coastcross-1' pasture treated with Azospirillum brasilense. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 55: e01242, ISSN: 1678-3921. https://doi.org/10.1590/S1678-3921.pab2020.v55.01242. encontraron en millo perla aumento de la colonización micorrízica y disminución del 50 % de la dosis de estiércol vacuno, cuando su aplicación se combinó con la inoculación con A. brasilense y G. mosseae.

También se debe señalar el efecto positivo que ejercen los HMA en cooperación con otros microorganismos del suelo, en cuanto a la mineralización de la MO y consecuentemente, la absorción del N y otros nutrientes derivados de este proceso (Jiang et al. 2021Jiang, Sh., An, X., Shao, Y., Kang, Y., Chen, T., Mei, X., Dong, C., Xu, Y. & Shen, Q. 2021. Responses of arbuscular mycorrhizal fungi occurrence to organic fertilizer: A meta‑analysis of field studies. Plant and Soil, 469(1-2): 89-105, ISSN: 1573-5036. https://doi.org/10.1007/s11104-021-05153-y.). Si a ello se suma el aporte de nutrientes del estiércol y sus posibles efectos en la mejora de las propiedades físicas del suelo (Sisouvanh et al. 2021Sisouvanh, P., Trelo-ges, V., Isarangkool Na Ayutthaya, S., Pierret, A., Nunan, N., Silvera, N., Xayyathip, K. & Hartmann, C. 2021. Can organic amendments improve soil physical characteristics and increase maize performances in contrasting soil water regimes?. Agriculture, 11: 132, ISSN: 2077-0472. https://doi.org/10.3390/agriculture11020132.), se puede comprender el mayor efecto de la adición conjunta del abono orgánico y los biofertilizantes en los rendimientos de Tithonia con respecto a la biofertilización sola, así como en la reducción de la necesidad de aplicar dosis complementarias de fertilizante nitrogenado, al menos durante el primer año de su cultivo. La disminución de los rendimientos obtenida con la aplicación de 100 kg ha^-1 de N en presencia de los biofertilizantes y el estiércol y la reducción de las variables fúngicas observada en este tratamiento reafirman la disminución de la actividad de la biofertilización ante una dosis de N que, en este caso, resultó excesiva para la titonia biofertilizada y abonada con estiércol durante el período en que se realizó el experimento.

Al evaluar el efecto de los tratamientos en las extracciones de los macronutrientes primarios (N, P y K) con la biomasa de la parte aérea durante el período en que se ejecutó el experimento (tabla 8), se observó aumento creciente de los tres elementos con el incremento de la fertilización nitrogenada sin biofertilizantes ni estiércol. En los tratamientos biofertilizados, las extracciones fueron mayores, sobre todo cuando se combinaron con las dosis de 70 y 100 kg ha^-1 de N. Pero los valores más altos se obtuvieron con la aplicación combinada de los biofertilizantes y el estiércol, excepto cuando se adicionó N a razón de 100 kg ha^-1.

Tabla 8. Efectos de la fertilización nitrogenada, la biofertilización y la aplicación de estiércol vacuno en las extracciones de N, P y K con la biomasa de la parte aérea de Tithonia

Tratamientos
N, kg ha^-1	Estiércol vacuno, t ha^-1	Biofertilización	N, kg ha^-1	P, kg ha^-1	K, kg ha^-1
0	0	NB	321.8^f	32.8^d	280.5^e
70	0	NB	376.3^e	36.6^c	321.4^d
100	0	NB	441.8^d	40.3^b	343.7^c
0	0	B	479.6^c	38.7^c	355.5^c
70	0	B	619.0^b	48.8^b	420.7^b
100	0	B	615.3^b	47.4^b	418.6^b
0	25	B	768.5^a	54.8^a	483.7^a
70	25	B	767.9^a	52.6^a	471.3^a
100	25	B	579.1^b	50.0^ab	421.8^b
ES±			6.925	1.233	5.720
P			0.0001	0.0001	0.0001

Cuantitativamente, las extracciones siguieron el orden N>K>P y concuerdan con lo encontrado por Botero Londoño et al. (2019)Botero Londoño, J.M., Gómez Carabali, M. & Botero Londoño, M.A. 2019. Nutrient absorption in Tithonia diversifolia. Universitas Scientiarum, 24(1): 33-48, ISSN: 2027-1352. https://doi.org/10.11144/Javeriana.SC24-1.nait. y Astúa et al. (2020)Astúa M., Rojas, A. & Campos C.M. 2020. Extracción de nutrientes del botón de oro (Tithonia diversifolia) ecotipo INTA-Quepos a tres edades de rebrote con tres niveles de fertilización nitrogenada. Nutrición Animal Tropical, 14(2): 113-130, ISSN: 2215-3527. https://doi.org/10.15517/nat.v14i2.44682.. Los primeros autores también encontraron niveles de extracción de hasta 800, 140 y 462 kg ha^-1 de N, P y K con densidades de plantación de 1 m² por planta y aplicaciones de 25, 12 y 11 kg por planta de N, P₂O₅ y K₂O.

Si bien los niveles de exportación de nutrientes con la biomasa de Tithonia dependen de la fertilidad del suelo, la aplicación de fertilizantes, la distancia de plantación y las variedades, entre otros factores. Los resultados obtenidos por los autores citados y también los de este trabajo reafirman que el cultivo es altamente extractor de nutrientes del suelo. Además, a pesar de su rusticidad y pocos requerimientos edáficos, la fertilización resulta vital, no sólo para elevar y sostener los rendimientos de forraje en el tiempo, sino para mantener la fertilidad del suelo. Ello implica, sobre todo cuando se somete a cortes frecuentes para la producción de forraje, la necesidad de monitorear la dinámica de los nutrientes en el suelo y las exportaciones de estos con la biomasa y los rendimientos, con el propósito de hacer las correcciones pertinentes para mantener los rendimientos y evitar el agotamiento del suelo.

Integrated management of the fertilization for Tithonia diversifolia forage production

Introduction

Materials and Methods

Experimental conditions

Treatments and experimental design

Inoculants used

Soil preparation, sowing, inoculants application and fertilization

Samplings and evaluations

Statistical analysis

Results and Discussion

Conclusions

Acknowledgments

References

Manejo integrado de la fertilización para la producción de forraje de Tithonia diversifolia