Materials and Methods

Some samples of T. diversifolia were collected in 31 places distributed in Colombia and Mexico. In Colombia, the collections were conducted in six eco-regions: Eje Cafetero (EEC), Valle del Río Cesar (EVRC), Piedemonte orinocense (EPO), Bajo Magdalena (EBM), Caquetá (CAQ), and Santander y Boyacá (ESB); and, in Mexico, in the states of Michoacán (MICH) and Jalisco (JAL).

For the DNA extraction, the DNeasyPlant mini Kit (Qiagen ®) commercial kit was used. The PCR amplifications were performed according to the protocols developed in the Laboratory of Molecular Biology at the Technological Institute of Tlajomulco (Mexico). For the amplification of the fragments, forty-five primers were assessed; out of which, eleven were selected (seven oligos ISSR or Inter Simple Sequence Repeats and four for the cytochrome gene P450) (Yamanaka et al. 2003Yamanaka, S., Suzuki, E., Tanaka, M., Takeda, Y., Watanabe, J.A. & Watanabe, K.N 2003. "Assessment of cytochrome P450 sequences offers a useful tool for determining genetic diversity in higher plant species". Theoretical Applied Genetics, 108(1):1-9, ISSN: 1432-2242. https://doi.org/10.1007/s00122-003-1403-0.).

The generated data were analyzed by means of a grouping, using the UPGMA method (Unweighted Pair-Group Method), and a dendrogram was generated by means of the NTSYS statistical software (Numerical Taxonomy System for Personal Computer, version 2.02 PC), which served to establish genetic distances. Each oligo was calculated the number of observed and effective alleles, (Na, Ne), number of polymorphic bands (P), index of genetic diversity of Nei (H) and index of Shannon (I) with the utilization of the POPGENE software, version 3.2 (Yeh et al. 1999Yeh, F.C., Yang, R.C. & Boyle, T. 1999. POPGENE, the user-friendly shareware for population genetic analysis. Molecular biology and biotechnology center, University of Alberta, Canada.).

Results and Discussion

Out of a total of 105 amplified fragments, 5 % were monomorphic and 95 % polymorphic. The size of the DNA fragments from the PCR varied from 300 up to 2,500 pb. The measures of genetic variation are shown in table 1. The amount of effective alleles in the ISSR under study varied from 1.0 to 1.9. The diversity values (H) brought about a total of 6.0 % to 48.8 % of heterozygosis. The Shannon data indices (I) ranged from 0.13 a 0.67, representing a measure of genetic diversity with an average of 0.432 ± 0.227 (table 1) and showing high polymorphism in T. diversifolia.

The cluster had a high cophenetic correlation (0.874) and a clustering coefficient of 0.8, which meant high correspondence among groups and differences among them (figure 1). The dendrogram served to separate the genotypes and, thus, generate data for the selection in each group.

Figure 2 shows the genetic structure of the 31 collections of T. diversifolia under study. The analysis based on the genome ratio of each population showed five well-defined groups, which agreed with the grouping obtained in the clustering analysis (figure 1).

The genetic structure clearly showed the existence of homogenous groups that can be used as selection criteria for materials to be improved and adapted to each soil and climate condition. Previous studies have proven that T. diversifolia has great phenotype diversity, variability that has favored its productivity, nutritional composition, and adaptability to different productive conditions (Yang et al. 2012Yang, J., Tang, L., Guan, Y. & Sun, W. 2012. "Genetic Diversity of an Alien Invasive Plant Mexican Sunflower (Tithonia diversifolia) in China". Weed Science, 60: 552-557, ISSN: 1550-2759. https://doi.org/10.1614/WS-D-11-00175.1. and Luo et al. 2016Luo, L., Zhang, P., Ou, X. & Geng, Y. 2016. "Development of EST-SSR markers for the invasiveplant Tithonia diversifolia (Asteraceae)". Applications in Plant Sciences, 4 (7): 1600011, ISSN: 2168-0450. http://doi.org/10.3732/apps.1600011.). These aspects have been assessed by Ruiz et al. (2010)Ruiz, T. E., Febles, G., Torres, V., González, J., Achan, G., Sarduy, L. & Díaz, H. 2010. "Evaluación de materiales recolectados de Tithonia diversifolia (Hemsl.) Gray en la zona centro-occidental de Cuba". Revista Cubana de Ciencia Agrícola, 44(3): 291-296, ISSN: 0034-7485. and Holguín et al. (2015)Holguín, V.A., Ortiz, S., Velasco, A. & Mora, J. 2015. "Evaluación multicriterio de 44 introducciones de Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray en Candelaria, Valle del Cauca". Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 62(2): 57-72, ISSN: 0120-2952. http://dx.doi.org/10.15446/rfmvz.v62n2.51995. , who identified that this species may vary considerably as to regrowth capacity, agronomic performance, and chemical composition.

Materials and Methods

The assessment of the genetic diversity was complemented with some growth measures in the field to choose the genotypes to be studied in experimental plots. The weighted forage potential index (WFPI) was used in each cluster (Holguín et al. 2015Holguín, V.A., Ortiz, S., Velasco, A. & Mora, J. 2015. "Evaluación multicriterio de 44 introducciones de Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray en Candelaria, Valle del Cauca". Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 62(2): 57-72, ISSN: 0120-2952. http://dx.doi.org/10.15446/rfmvz.v62n2.51995. ) in the genetic analysis to compare and identify the plant materials of highest agronomic potential, which were those of greatest valuation. The identified materials (7) were spread as clones in the laboratory, and were sown in three plots arranged in a completely randomized block design using all the materials in two localities: Environment (1) low tropics without fertilization - REG1, Environment (2) low tropics with fertilization - REG1Fert, and Environment (3) high tropics without fertilization - REG2. For the selection of the localities, representative criteria for soil and climate were used in the sites, as well as growth potential of T. diversifolia (rainfall, temperature, sun radiation, soil and cattle breeding potential).

The experimental plots corresponded to environments 1 and 2. They were sown in the municipality of San Luis de Cubarral (Meta, Colombia) at 530 m a.s.l., with average annual rainfall of 4100 mm, and average temperature of 24.8 ºC, classified as tropical humid rainforest (bh-T) (Holdridge 1986Holdridge, L. R. 1986. Ecología basada en zonas de vida. Leslie Holdridge. IICA. San José, Costa Rica.) (3°47'21.43"N, 73°49'15.93"O). The plots in the environment 3 were sown in the municipality of Villamaría (Caldas, Colombia) (5°0'44.92"N, 75°25'47.28"O), at an altitude of 2,300 m a.s.l., with average temperature of 15 ºC, and annual rainfall of 2850 mm, corresponding to low mountainous humid rainforest (bmh-MB) (Holdridge 1986Holdridge, L. R. 1986. Ecología basada en zonas de vida. Leslie Holdridge. IICA. San José, Costa Rica.).

For analyzing GxE interaction for biomass yield, two non-parametric methods were used: AMMI analysis (Additive Main Effects and Multiplicative Interaction) (Mandel 1971Mandel, J. 1971. "A new analysis of variance model fornon-additive data". Technometrics, 13: 1-18, ISSN: 1537-2723.) and SREG analysis (Site Regression Analysis) (Yan et al. 2000Yan, W., Hunt, L.A., Sheng, Q. & Szlavnics, Z., 2000. "Cultivar evaluation and mega environment investigation based on the GGE biplot". Crop Science, 40(3): 597-605, ISSN: 1435-0653. https://doi.org/10.2135/cropsci2000.403597x. ). Two samplings were carried out in rainy season, and two, in dry season, every 40 and 60 d, respectively, in each locality.

Results and Discussion

In REG1 and REG1Fert environments, the plant materials of greatest yield were Gen7 (106.51 g) and Gen5 (85.92 g). Those of lowest DM yield were Gen1, Gen4 and Gen3, with averages of 65.85, 68.67, and 73.54 g of DM every 40 d. Figure 3 shows the representation of each of the plant materials in each environment according to DM yield.

As average, DM yield in rainy season was 1.4 times higher than in dry season. The use of fertilizers increased DM/plant in 98.6 % as average in both seasons, with greater influence in rainy season (2.3 times). The materials of best response to fertilization were genotypes 2, 4, and 6; and those of worst response were 7 and 3. The genotypes with best response in dry season, represented by lower decline in biomass yield in respect to rainy season, were genotypes 3, 1, and 2; although none were in the group of genotypes with best performance in these conditions. Genotypes 4 and 1 were those contributing the most to variability for being further away from the axes represented by each of the environments in REG1.

For REG2 (figure 3), the materials with greatest yield were Gen4 and Gen7, with DM yields per plant of 152.63 and 128.87 g, respectively, despite having greater variability. The materials of lowest yield were Gen1, Gen3 and Gen6, with 63.58, 82.73, and 94.42 g of DM/plant every 60 d, respectively. In this area, the materials decreased their yield in 13.5 % as average, compared to the rainy and dry seasons. The materials in which season influenced the least were Gen5 and Gen6.

In the analysis of variance of the AMMI model (table 2), the genotypes, as well as the environments and the GxE interaction, presented significant differences for DM yield per plant (p<0.05). This condition is shown graphically in figure 4. The plant materials Gen7 and Gen5 were associated with the best yields in the areas REG1 and REG1Fert, and Gen4, in REG2. Gen7 and Gen5 were identified as ideal genotypes since they were closer to the origin of the circumferences shown in figure 5.

Finally, according to the index of Shukla, Gen7 and Gen5 were the most stable. This is due to their relative high productive yield, which was determined in the three environments under study, and due to the low variability.

Materials and Methods

Seven outstanding T. diversifolia genotypes were assessed and identified in experimental plots in high tropical (5°0'44.92"N, 75°25'47.28"O - 2,300 m a.s.l.) and low tropical conditions (3°47'21.43"N, 73°49'15.93"O - 530 m a.s.l.), according to descriptions previously presented in papers on GxE interaction. The genotypes were mixed with pasture traditionally used in each locality, according to Donneys et al. (2015)Donneys, G., Molina, I.C., Rivera, J.E., Villegas, G., Chará, J. & Barahona. R. 2015. Producción in vitro de metano de dietas ofrecidas en sistemas silvopastoriles intensivos con Tithonia diversifolia y sistemas tradicionales. 3er Congreso Nacional de Sistemas Silvopastoriles y VIII Congreso Internacional de Sistemas Agroforestales. Puerto Iguazú, Misiones, Argentina, 672-677 pp. and Molina et al. (2015)Molina, I.C., Donneys, G., Montoya, S., Villegas, G., Rivera, J.E, Chará, J., Lopera, J.J. & Barahona, R. 2015. Emisiones in vivo de metano en sistemas de producción con y sin inclusión de Tithonia diversifolia. 3er Congreso Nacional de Sistemas Silvopastoriles y VIII Congreso Internacional de Sistemas Agroforestales. Puerto Iguazú, Misiones, Argentina, 678-682 pp.. As stated by these authors, the intake in T. diversifolia systems at high density associated with Cenchrus clandestinus (Hochst. ex Chiov.) is 80 % pasture and 20 % shrub (High tropics), out of the total DM in the diet. For the mixture with pastures of the Urochloa genus, such as Urochloa brizantha cv Marandú, the intake is 75 % for pasture and 25 % for T. diversifolia (low tropics) (DM of the diet).

Fermentative performance, methane production (CH₄), generation of short-chain volatile fatty acids (VFA), and DM degradability of different plant materials were studied by means of the in vitro gas production technique (Theodorou et al.1994Theodorou, M.K., Williams, B.A., Dhanoa, M.S., McAllan, A.B. & France, J. 1994. "A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feeds". Animal Feed Science and Technology, 48 (3-4): 185-197, ISSN: 0377-8401. https://doi.org/10.1016/0377-8401(94)90171-6. ), with use of a completely randomized design (Rivera et al. 2021bRivera-Herrera, J., Chará, J., Arango, J. & Barahona-Rosales, R. 2021b. "Effect of different genotypes of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Grey. on fermentation of feed mixtures with Urochloabrizantha cv. Marandú". Crop and Pasture Science, 72(10): 850 - 859, ISSN: 1836-5795. https://doi.org/10.1071/CP21102 ).

Results and Discussion

For low tropics conditions, T. diversifolia inclusion provoked significant differences in all the variables measured, except ether extract and crude energy (p<0.05), for the diet based on U. brizantha, but there were no differences among diets including T. diversifolia. In general, the inclusion of T. diversifolia decreased DM and fiber content in the diet, but augmented minerals and nitrogen-free extract supply, besides improving DM degradability (p<0.05). Also, it is noteworthy that the use of fertilization in T. diversifolia increased CP, Ca, P, and Enl, and degradability in respect to diets of T. diversifolia without fertilization.

The inclusion of T. diversifolia in diets based on U. brizantha modified some parameters of in vitro rumen fermentation. Its use had significant effects on the variables of maximum rate of gas production (MRGP) and lag phase (LP, time taken for colonization of rumen feed, and fermentation start) (p<0.05), but not on the inflection point time (IPT) and gas at the inflection point (GIP). The fertilization of T. diversifolia represented significant rise in the maximum rate of gas production, as compared to the diets without fertilization (p<0.05). Among the mixtures, the genotypes 1, 3, and 7 presented lower values of MRGP. The mixture of the genotypes 2 and 3 showed higher values of LP (p=0.007). According to the chemical characteristics of the genotypes of T. diversifoliay and C. clandestinus (high tropics) and according to the percentage of inclusion, the inclusion of the shrub had significant (p>0.05) effects on none of the parameters under study for this grass.

As to DM degradability, T. diversifolia and U. brizantha mixtures had differences at 24 h time, but diet fermentation at 72 h including T. diversifolia presented, as average, 4.72 % more DM degradation than the diet with 100 % grass (p<0.05), but without differences with those including T. diversifolia. The fertilized materials had significant differences in regards to the diets with T. diversifolia genotypes without fertilization (p<0.05). In respect to high tropics diets, the inclusion of different T. diversifolia genotypes in diets based only on C. clandestinus, disminished in 4.6 %, significantly, the degradation at both times. However, there were not differences in the T. diversifolia mixtures.

As to VFA production at 24 h of incubation, U. brizantha had lower production of propionic acid (mol/100 mol) with differences among mixtures including genotypes 5, 6, and 7 of T. diversifolia (p=0.0321). Genotypes 2 and 4 were those of largest amount of acetic acid, and the Gen6 diet produced the lowest values of total VFA for T. diversifolia mixtures (mol/100 mol). The A:P ratio had also significant differences, with the highest values in the diet of 100 % U. brizantha (p=0.004), condition also found for acetic acid (p=0.012). At 72 h, the production of acetic, propionic, and butyric acid, total production of total VFA, and the A:P ratio had significant (p<0.05) differences for the values in mol/100 mol, as for Mmol/L. The inclusion of T. diversifolia produced lower amounts of acetic acid and higher production of propionic acid; besides, the A:P ratio was lower in all T. diversifolia diets. The mixture of Gen4, Gen7and 100 % U. brizantha were the trials with lower production of butyric acid. Meanwhile, the diets Gen4 and 100 % U. brizantha were those of highest production of total VFA, with significant differences in respect to the mixtures Gen1, Gen5 and Gen6. The use of fertilizer had significant differences in the acetic, propionic and butyric acids variables, as well as in the A:P ratio.

As to methane production in low tropics diets, T. diversifolia inclusion diminished significantly the CH₄production in respect to the diet with 100 % U. brizantha, especially in the emissions per mg of CH₄/g of DMD at 72 h. As average, at 72 h, the use of the shrub declined in 1.2, 2.42, and 5.79 units of Ym, mg de CH₄/g of IDM and mg of CH₄/g of DDM, respectively. Moreover, in T. diversifolia mixtures, Gen2, Gen4, and Gen7 had the lowest emissions in terms of mg de CH₄/g of IDM (p=0.006), and the highest Ym was that of 100 % U. brizantha and the diet with Gen6. In the diets under study, fertilization had neither significant effect nor differences in the mixtures including mg of CH₄/g of IDM (p=0.006), and the highest Ym was that of 100 % U. brizantha and the diet with Gen6. For the evaluated diets, fertilization had no significant effect or differences among the mixtures that included T. diversifolia (Rivera et al. 2021Rivera, J.E., Ruiz, T.E., Chará, J., Gómez-Leyva, J.F. & Barahona, R. 2021a. "Biomass production and nutritional properties of promising genotypes of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray under different environments". Tropical Grasslands-Forrajes Tropicales, 9(3): 280-291, ISSN: 2346-3775. https://doi.org/10.17138/tgft(9)280-291 ), and in the diets of the high tropics the T. diversifolia inclusion did not have significant differences for the units of measure and the times under study (p>0.05).

Materials and Methods

Seven outstanding genotypes of T. diversifolia were assessed and identified as to genetic diversity, and they were examined in the aforementioned trials.

The variables vegetative stage length (d), reproductive stage length (d), length of the drying of the achenes (d), flowering stage (d), flowerheads per plant (#), seeds per flowerhead (#), seeds per plant (#), full seeds (%), empty seeds (%), and rudimentary seeds (%) were measured. Besides, two trials were evaluated prior to germination, and one trial, without previous processing for sexual seed germination. The trials prior to germination were water at 80ºC during 10 min, according to Akinola et al. (2000)Akinola, J.O., Larbi, A., Farinu, G. O. & Odunsi, A.A. 2000. "Seed treatment methods and duration effects on germination of wild sunflower". Experimental Agriculture, 36(1): 63 - 69, ISSN: 1469-4441. https://doi.org/10.1017/S0014479700361075. , Agboola et al. (2005)Agboola, D.A., Idowu, W.F. &Kadiri, M. 2006. "Seed germination and seedling growth of the Mexican sunflower Tithonia diversifolia (Compositae) in Nigeria, Africa". Revista de Biología Tropical, 54 (2): 395-402, ISSN: 0034-7744. and Nasreen et al. (2015)Nasreen, S., Khan, M.A. & Uddin, S. 2015. "Response of sunflower to various pre-germination techniques for breaking seed dormancy". Pakistan Journal of Botany, 47(2): 413-416, ISSN: 0556-3321., and sulfuric acid (H₂SO₄) at 50 % during 5 min (Muoghalu and Chuba 2005Muoghalu, J.I. & Chuba, D.K. 2005. "Seed germination and reproductive strategies of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray and Tithonia rotundifolia (P.M.) Blake". Applied Ecology and Environmental Research, 3(1): 39 - 46, ISSN: 1589-1623.). The seeds were stored after collection for four months with the goal of reducing the physiological latency (Agboola et al. 2005Agboola, D.A., Idowu, W.F. &Kadiri, M. 2006. "Seed germination and seedling growth of the Mexican sunflower Tithonia diversifolia (Compositae) in Nigeria, Africa". Revista de Biología Tropical, 54 (2): 395-402, ISSN: 0034-7744. and Santos-Gally et al. 2020Santos-Gally, R., Muñoz, M. & Franco, G. 2020. "Fruit heteromorphism and germination success in the perennial shrub Tithonia diversifolia (Asteraceae)". Flora, 271: 151686, ISSN: 1618-0585. https://doi.org/10.1016/j.flora.2020.151686. ). Germination was evaluated in experimental pots in the laboratory for 20 days.

Results and Discussion

The genotypes assessed had significant differences in all growth variables, except for the time of the drying of the achenes, and the percentage of rudimentary seeds (p<0.05). Genotype 1 (140.1 d) was the material that demanded the longest time for growing and flowering combined (flowering stage). Genotype 4 (127.2 d) was the one having the shortest time with significant (p<0.05) differences.

In regards to sexual seed production, fertilization had significant effect by generating 2.14 times more seeds (p<0.05); and, in general, it increased the time in the stages under study in around five days. Genotypes 5 and 7 were the plant materials with the highest production of flowerheads per plant, the highest percentage of full seeds, and the largest number of seeds per plant, which was associated with the highest number of branches. Likewise, the percentage of empty seeds was noteworthy in all the genotypes, as well as that of rudimentary seeds, which accounted for the fact that more than 30 % of the seeds had no physical viability.

In regards to germination (table 3), there were significant differences among genotypes and trials (p =0.000118). As average, germination percentage was 46.87, 53.53, and 25.97 % for the control, the use of water at 80 ºC, and the sulfuric acid, respectively; and this process started at three days after sowing. The germination of seeds without treatment was significantly lower in the genotype 1, as compared with the other six genotypes (p<0.0001). Moreover, this same genotype had the lowest values when water and sulfuric acid treatments were used, but it did not show significant differences in respect to genotypes 2 and 7. Fertilization increased, as average, 9.2 % the germination of the different genotypes. The trial that reached the best germination was that of the use of water at 80 ºC; and the worst germination was that of sulfuric acid. On the whole, genotypes 3 and 6 were the ones having the best germination percentages, but they had significant differences, only with genotype 1.

Materiales y Métodos

Se colectaron ejemplares de T. diversifolia en 31 sitios, distribuidos en Colombia y México. En Colombia, las colectas se realizaron en seis ecorregiones: Eje Cafetero (EEC), Valle del Río Cesar (EVRC), Piedemonte orinocense (EPO), Bajo Magdalena (EBM), Caquetá (CAQ), y Santander y Boyacá (ESB). En México, en los estados de Michoacán (MICH) y Jalisco (JAL).

Para la extracción de ADN se usó el kit comercial DNeasy Plant mini Kit (Qiagen ®). Las amplificaciones de PCR se realizaron de acuerdo con los protocolos desarrollados en el Laboratorio de Biología Molecular del Instituto Tecnológico de Tlajomulco (México). Para la amplificación de los fragmentos, se evaluaron 45 iniciadores, de los que se seleccionaron 11 (siete oligos ISSR Inter Simple Sequence Repeats y cuatro para el gen citocromo P450) (Yamanaka et al. 2003Yamanaka, S., Suzuki, E., Tanaka, M., Takeda, Y., Watanabe, J.A. & Watanabe, K.N 2003. "Assessment of cytochrome P450 sequences offers a useful tool for determining genetic diversity in higher plant species". Theoretical Applied Genetics, 108(1):1-9, ISSN: 1432-2242. https://doi.org/10.1007/s00122-003-1403-0.).

La información generada se analizó por medio de un agrupamiento, utilizando el método UPGMA (unweighted pair-group method) y se generó un dendrograma mediante el paquete estadístico NTSYS (Numerical Taxonomy System for personal Computer, versión 2.02 PC), que sirvió para establecer distancias genéticas. Para cada oligo, se calculó el número de alelos observados y efectivos (Na, Ne), número de bandas polimórficas (P), índice de diversidad genética de Nei (H) e índice de Shannon (I) con la utilización del software POPGENE, versión 3.2 (Yeh et al. 1999Yeh, F.C., Yang, R.C. & Boyle, T. 1999. POPGENE, the user-friendly shareware for population genetic analysis. Molecular biology and biotechnology center, University of Alberta, Canada.).

Resultados y Discusión

De un total de 105 fragmentos amplificados, 5 % fueron monomórficos y 95 % polimórficos. El tamaño de los fragmentos de ADN, producto de la PCR, varió desde los 300 hasta 2,500 pb. Las medidas de variación genética se muestran en la tabla 1. La cantidad de alelos efectivos en los ISSR estudiados varió de 1.0 a 1.9. Los valores de diversidad (H) dejaron ver un total de 6.0 % a 48.8 % de heterocigosidad. Los índices de información de Shannon (I) fueron de 0.13 a 0.67, lo que representa una medida de diversidad genética con un promedio de 0.432 ± 0.227 (tabla 1) e indica el alto polimorfismo en T. diversifolia.

El conglomerado tuvo correlación cofenética alta (0.874) y coeficiente de aglomeración de 0.8, lo que significó alta correspondencia entre grupos y diferencias entre ellos (figura 1). El dendrograma sirvió para separar los genotipos, y así generar información para su selección en cada grupo.

En la figura 2 se muestra la estructura genética de las 31 colectas de T. diversifolia evaluadas. El análisis basado en la proporción del genoma de cada población mostró cinco grupos bien definidos, que coinciden con el agrupamiento obtenido en el análisis de conglomerados (figura 1).

La estructura genética mostró claramente la existencia de grupos homogéneos que se pueden emplear como un criterio de selección de materiales con fines de mejoramiento y adaptación a cada condición edafoclimática. Estudios anteriores han mostrado que T. diversifolia cuenta con gran diversidad fenotípica, variabilidad que ha favorecido su productividad, composición nutricional y adaptabilidad a diferentes condiciones de producción (Yang et al. 2012Yang, J., Tang, L., Guan, Y. & Sun, W. 2012. "Genetic Diversity of an Alien Invasive Plant Mexican Sunflower (Tithonia diversifolia) in China". Weed Science, 60: 552-557, ISSN: 1550-2759. https://doi.org/10.1614/WS-D-11-00175.1. y Luo et al. 2016Luo, L., Zhang, P., Ou, X. & Geng, Y. 2016. "Development of EST-SSR markers for the invasiveplant Tithonia diversifolia (Asteraceae)". Applications in Plant Sciences, 4 (7): 1600011, ISSN: 2168-0450. http://doi.org/10.3732/apps.1600011.). Estos aspectos se han evaluado por Ruiz et al. (2010)Ruiz, T. E., Febles, G., Torres, V., González, J., Achan, G., Sarduy, L. & Díaz, H. 2010. "Evaluación de materiales recolectados de Tithonia diversifolia (Hemsl.) Gray en la zona centro-occidental de Cuba". Revista Cubana de Ciencia Agrícola, 44(3): 291-296, ISSN: 0034-7485. y Holguín et al. (2015)Holguín, V.A., Ortiz, S., Velasco, A. & Mora, J. 2015. "Evaluación multicriterio de 44 introducciones de Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray en Candelaria, Valle del Cauca". Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 62(2): 57-72, ISSN: 0120-2952. http://dx.doi.org/10.15446/rfmvz.v62n2.51995. , quienes identificaron que esta especie puede variar considerablemente en su capacidad de rebrote, desempeño agronómico y composición química.

Materiales y Métodos

Las evaluaciones de diversidad genética se complementaron con algunas medidas de crecimiento en campo para seleccionar los genotipos a estudiar en parcelas experimentales. Se utilizó el índice de potencial forrajero ponderado (IPFP) en cada conglomerado (Holguín et al. 2015Holguín, V.A., Ortiz, S., Velasco, A. & Mora, J. 2015. "Evaluación multicriterio de 44 introducciones de Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray en Candelaria, Valle del Cauca". Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 62(2): 57-72, ISSN: 0120-2952. http://dx.doi.org/10.15446/rfmvz.v62n2.51995. ) construido en el análisis genético para comparar e identificar los materiales con mayor potencial agronómico, que fueron los de mayor valoración. Los materiales identificados (7) se propagaron clonalmente en laboratorio y se establecieron tres parcelas dispuestas en un diseño de bloques completos al alzar con todos los materiales y en dos localidades: Ambiente 1) trópico bajo sin fertilización - REG1; Ambiente 2) trópico bajo con fertilización - REG1Fert; Ambiente 3) trópico alto sin fertilización - REG2). Para la selección de los sitios, se utilizaron los criterios de representatividad edafoclimática del lugar y potencialidad de crecimiento de T. diversifolia (precipitación, temperatura, radiación solar, suelo y vocación ganadera).

Las parcelas experimentales correspondientes a los ambientes 1 y 2 se establecieron en el municipio de San Luis de Cubarral (Meta, Colombia) a 530 m s.n.m., con precipitación media anual de 4100 mm, temperatura promedio de 24.8 ºC, clasificado como bosque húmedo tropical (bh-T) (Holdridge 1986Holdridge, L. R. 1986. Ecología basada en zonas de vida. Leslie Holdridge. IICA. San José, Costa Rica.) (3°47'21.43"N, 73°49'15.93"O). Las parcelas del ambiente 3 se establecieron en el municipio de Villamaría (Caldas, Colombia) (5°0'44.92"N, 75°25'47.28"O), a una altitud de 2300 m s.n.m., con temperatura media de 15 ºC y precipitación anual de 2850 mm año, lo que se corresponde con un bosque húmedo montano bajo (bmh-MB) (Holdridge 1986Holdridge, L. R. 1986. Ecología basada en zonas de vida. Leslie Holdridge. IICA. San José, Costa Rica.).

Para el análisis de la interacción GxA de la producción de biomasa, se utilizaron dos métodos no paramétricos: el análisis tipo AMMI y el análisis SREG. Se hicieron dos muestreos en época de lluvias y dos en época seca, cada 40 y 60 d respectivamente en cada localidad.

Resultados y Discusión

En los ambientes REG1 y REG1Fert, los materiales con mayor rendimiento fueron el Gen7 (106.51 g) y el Gen5 (85.92 g). Los de menor rendimiento de MS fueron el Gen1, Gen4 y Gen3, con promedio de 65.85, 68.67 y 73.54 g de MS cada 40 d. La figura 3 muestra la representación de cada uno de los materiales en cada ambiente, de acuerdo con su rendimiento de MS.

Como promedio, la producción de MS en la época de lluvias fue de 1.4 veces superior con respecto a lo encontrado en la época de bajas precipitaciones. El uso de fertilizantes incrementó la MS/planta en 98.6 % como promedio en las dos épocas, con mayor influencia en la época de lluvias (2.3 veces). Los materiales con mayor respuesta a la fertilización fueron los genotipos 2, 4 y 6, y los de menor respuesta, el 7 y 3. Los genotipos con mejor respuesta en la época seca, representada por menor disminución de la producción de biomasa con respecto a la época de lluvias, fueron los genotipos 3, 1 y 2, aunque ninguno estuvo en el grupo de genotipos con mejor desempeño en estas condiciones. Los genotipos 4 y 1 resultaron los que más aportaron a la variabilidad, al estar más alejados de los ejes representados por cada uno de los ambientes en REG1.

Para la zona REG2 (figura 3), los materiales con mayor producción fueron el Gen4 y el Gen7, con rendimientos de MS por planta de 152.63 y 128.87 g, respectivamente, a pesar de presentar mayor variabilidad. Los materiales con menor rendimiento fueron Gen1, Gen3 y Gen6, con 63.58, 82.73 y 94.42 g de MS/planta cada 60 d, respectivamente. En esta zona, los materiales disminuyeron su rendimiento en 13.5 % como promedio, con respecto a la época de lluvias y la de sequía. Los materiales con menor efecto de la época fueron el Gen5 y Gen6.

En el análisis de varianza del modelo AMMI (tabla 2), los genotipos como los ambientes y la interacción GxA presentaron diferencias significativas para el rendimiento de MS por planta (p<0.05). Esta condición se presenta gráficamente en la figura 4. Los materiales Gen7 y Gen5 se asocian a mejores rendimientos en las zonas REG1 y REG1Fert, y Gen4 en REG2. Como genotipos ideales se identificaron Gen7 y Gen5 porque se encontraban más cercanos al origen de las circunferencias presentadas en la figura 5.

Finalmente, según el índice de Shukla, los Gen7 y Gen5 fueron los más estables. Esto se debe a su relativo alto rendimiento productivo, que se determinó a través de los tres ambientes estudiados y baja variabilidad.

Materiales y Métodos

Se evaluaron los siete genotipos destacados de T. diversifolia, identificados en parcelas experimentales en condiciones de trópico de altura (5°0'44.92"N, 75°25'47.28"O - 2300 m s.n.m.) como de trópico bajo (3°47'21.43"N, 73°49'15.93"O - 530 m s.n.m.), de acuerdo con las descripciones anteriormente presentadas en los trabajos de interacción GxA. Los genotipos se mezclaron con pasturas utilizadas tradicionalmente en cada localidad, de acuerdo con Donneys et al. (2015)Donneys, G., Molina, I.C., Rivera, J.E., Villegas, G., Chará, J. & Barahona. R. 2015. Producción in vitro de metano de dietas ofrecidas en sistemas silvopastoriles intensivos con Tithonia diversifolia y sistemas tradicionales. 3er Congreso Nacional de Sistemas Silvopastoriles y VIII Congreso Internacional de Sistemas Agroforestales. Puerto Iguazú, Misiones, Argentina, 672-677 pp. y Molina et al. (2015)Molina, I.C., Donneys, G., Montoya, S., Villegas, G., Rivera, J.E, Chará, J., Lopera, J.J. & Barahona, R. 2015. Emisiones in vivo de metano en sistemas de producción con y sin inclusión de Tithonia diversifolia. 3er Congreso Nacional de Sistemas Silvopastoriles y VIII Congreso Internacional de Sistemas Agroforestales. Puerto Iguazú, Misiones, Argentina, 678-682 pp.. Según estos autores, el consumo en sistemas de T. diversifolia en alta densidad asociada con Cenchrus clandestinus (Hochst. ex Chiov.) es de 80 % de pastura y 20 % de arbustiva (trópico de altura) de la MS total de la dieta. Para la asociación con pasturas de género Urochloa, como Urochloa brizantha cv Marandú, el consumo es de 75 % para la pastura y 25 % de T. diversifolia (trópico bajo) (MS de la dieta).

El comportamiento fermentativo, la producción de metano (CH₄), la generación de ácidos grasos volátiles de cadena corta (AGV) y la degradabilidad de la MS de los diferentes materiales se estudiaron por medio de la técnica in vitro de producción de gases (Theodorou et al. 1994Theodorou, M.K., Williams, B.A., Dhanoa, M.S., McAllan, A.B. & France, J. 1994. "A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feeds". Animal Feed Science and Technology, 48 (3-4): 185-197, ISSN: 0377-8401. https://doi.org/10.1016/0377-8401(94)90171-6. ), con la utilización de un diseño de bloques completos al azar (Rivera et al. 2021bRivera-Herrera, J., Chará, J., Arango, J. & Barahona-Rosales, R. 2021b. "Effect of different genotypes of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Grey. on fermentation of feed mixtures with Urochloabrizantha cv. Marandú". Crop and Pasture Science, 72(10): 850 - 859, ISSN: 1836-5795. https://doi.org/10.1071/CP21102 ).

Resultados y Discusión

Para las condiciones de trópico bajo, la inclusión de T. diversifolia resultó en diferencias significativas en todas las variables medidas a excepción del extracto etéreo y la energía bruta (p<0.05) ante la dieta base de U. brizantha, pero no hubo diferencias entre las dietas que incluyeron T. diversifolia. En general, la inclusión de T. diversifolia disminuyó el contenido de MS y de fibra de la dieta, pero incrementó la oferta de minerales y extracto libre de nitrógeno, además de mejorar la degradabilidad de la MS (p<0.05). También se destaca que el uso de fertilización en T. diversifolia resulta en aumento de PC, Ca, P y Enl y degradabilidad con respecto a dietas de T. diversifolia, sin fertilizar.

La inclusión de T. diversifolia en dietas basadas en U. brizantha modificó algunos parámetros de fermentación ruminal in vitro. Su uso tuvo efectos significativos en las variables de tasa máxima de producción de gas (TMPG) y fase lag (FL, tiempo que demora la colonización de microrganismos del rumen al alimento e inicia su fermentación) (p<0.05), pero no en la hora al punto de inflexión (HPI) y gas al punto de inflexión (GPI). La fertilización de T. diversifolia representó incremento significativo en la tasa máxima de producción de gases con respecto a las dietas sin fertilizar (p<0.05). Entre las mezclas, los genotipos 1, 3 y 7 presentaron menores valores de TMPG. La mezcla de los genotipos 2 y 3 mostraron mayores valores de FL (p=0.007). De acuerdo con las características químicas de los genotipos de T. diversifolia y de C. clandestinus (trópico alto) y según porcentaje de inclusión, para ninguno de los parámetros estudiados la utilización de la arbustiva tuvo efectos significativos (p>0.05) con esta gramínea.

En la degradación de la MS, las mezclas de T. diversifolia y U. brizantha no tuvieron diferencias en el horario de las 24 h, pero a las 72 h de fermentación las dietas que incluyeron T. diversifolia presentaron, como promedio, 4.72 % más de degradación de la MS que la dieta con 100 % gramínea (p<0.05), pero sin diferencias entre las que incluyeron T. diversifolia. Los materiales fertilizados presentaron diferencias significativas con respecto a las dietas con los genotipos de T. diversifolia sin fertilizar (p<0.05). En lo que respecta a las dietas de trópico alto, la inclusión de los diferentes genotipos de T. diversifolia en dietas basadas solo en C. clandestinus, disminuyó en 4.6 % de forma significativa la degradación en ambos horarios. Sin embargo, entre las mezclas que tuvieron T. diversifolia no hubo diferencias.

En cuanto a la producción de AGV, a las 24 h de incubación U. brizantha tuvo menor producción de ácido propiónico (mol/100 mol) con diferencias ante las mezclas que incluyeron los genotipos 5, 6 y 7 de T. diversifolia (p=0.0321). Los genotipos 2 y 4 fueron los que generaron mayores cantidades de ácido acético y la dieta Gen6 fue la que produjo menores valores de AGV totales entre las mezclas con T. diversifolia (mol/100 mol). La relación A:P también presentó diferencias significativas con los mayores valores en la dieta 100 % U. brizantha (p=0.004), condición igualmente encontrada para la producción de ácido acético (p=0.012). En el horario de 72 h, la producción de ácido acético, propiónico, butírico, producción total de AGV totales y la relación A:P tuvieron diferencias significativas (p<0.05) para los valores en mol/100 mol, como para Mmol/L. La inclusión de T. diversifolia generó menores cantidades de ácido acético y mayor producción de propiónico, además, la relación A:P fue menor en todas las dietas con T. diversifolia. La mezcla de Gen4, Gen7 y U. brizantha 100 % fueron los tratamientos con menor producción de ácido butírico. En tanto, las dietas con Gen4 y 100 % U. brizantha fueron las que mayor producción de AGV totales generaron, con diferencias significativas con respecto a la mezcla Gen1, Gen5 y Gen6. El uso de fertilizante presentó diferencias significativas en las variables de ácido acético, propiónico y butírico, así como en la relación A:P.

En cuanto a la producción de metano en las dietas de trópico bajo, la inclusión de T. diversifolia disminuyó significativamente la producción de CH₄ con respecto a la dieta con 100 % de U. brizantha, especialmente en las emisiones por mg de CH₄/g de MSD a las 72 h. Como promedio, al horario de 72 h, el uso de la arbustiva disminuyó en 1.2, 2.42 y 5.79 unidades de Ym, mg de CH₄/g de MSI y mg de CH₄/g de MSD, respectivamente. Además, entre las mezclas con T. diversifolia, Gen2, Gen4 y Gen7 tuvieron las emisiones más bajas en términos de mg de CH₄/g de MSI (p=0.006), y el Ym más alto fue el de U. brizantha 100 % y la dieta con Gen6. Para las dietas evaluadas, la fertilización no tuvo efecto significativo ni diferencias entre las mezclas que incluyeron T. diversifolia (Rivera et al. 2021Rivera, J.E., Ruiz, T.E., Chará, J., Gómez-Leyva, J.F. & Barahona, R. 2021a. "Biomass production and nutritional properties of promising genotypes of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray under different environments". Tropical Grasslands-Forrajes Tropicales, 9(3): 280-291, ISSN: 2346-3775. https://doi.org/10.17138/tgft(9)280-291 ), y en las dietas de trópico alto la inclusión de T. diversifolia no tuvo diferencias significativas para las unidades de medición evaluadas ni en los horarios trabajados (p>0.05).

Materiales y Métodos

Se evaluaron los siete genotipos destacados de T. diversifolia, identificados en los trabajos de diversidad genética y estudiados en los demás experimentos antes presentados.

Se midieron las variables duración de la fase vegetativa (d), duración de la fase reproductiva (d), duración del secado de aquenios (d), fase de floración (d), cabezuelas por plantas (#), semillas por cabezuela (#), semillas por planta (#), semillas llenas (%), semillas vacías (%) y semillas rudimentarias (%). Además, se evaluaron dos tratamientos pregerminativos y un tratamiento sin proceso previo para la germinación de la semilla sexual. Los tratamientos pregerminativos fueron: agua a 80 ºC durante 10 min, según Akinola et al. (2000)Akinola, J.O., Larbi, A., Farinu, G. O. & Odunsi, A.A. 2000. "Seed treatment methods and duration effects on germination of wild sunflower". Experimental Agriculture, 36(1): 63 - 69, ISSN: 1469-4441. https://doi.org/10.1017/S0014479700361075. , Agboola et al. (2005)Agboola, D.A., Idowu, W.F. &Kadiri, M. 2006. "Seed germination and seedling growth of the Mexican sunflower Tithonia diversifolia (Compositae) in Nigeria, Africa". Revista de Biología Tropical, 54 (2): 395-402, ISSN: 0034-7744. y Nasreen et al. (2015)Nasreen, S., Khan, M.A. & Uddin, S. 2015. "Response of sunflower to various pre-germination techniques for breaking seed dormancy". Pakistan Journal of Botany, 47(2): 413-416, ISSN: 0556-3321., y ácido sulfúrico (H₂SO₄) al 50 % durante 5 min. (Muoghalu y Chuba 2005Muoghalu, J.I. & Chuba, D.K. 2005. "Seed germination and reproductive strategies of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray and Tithonia rotundifolia (P.M.) Blake". Applied Ecology and Environmental Research, 3(1): 39 - 46, ISSN: 1589-1623.). La semilla se almacenó durante cuatro meses después de colectada, con el objetivo de disminuir la latencia fisiológica (Agboola et al. 2005Agboola, D.A., Idowu, W.F. &Kadiri, M. 2006. "Seed germination and seedling growth of the Mexican sunflower Tithonia diversifolia (Compositae) in Nigeria, Africa". Revista de Biología Tropical, 54 (2): 395-402, ISSN: 0034-7744. y Santos-Gally et al. 2020Santos-Gally, R., Muñoz, M. & Franco, G. 2020. "Fruit heteromorphism and germination success in the perennial shrub Tithonia diversifolia (Asteraceae)". Flora, 271: 151686, ISSN: 1618-0585. https://doi.org/10.1016/j.flora.2020.151686. ). La germinación se evaluó en macetas experimentales en laboratorio durante 20 d.

Resultados y Discusión

Los genotipos evaluados tuvieron diferencias significativas en todas las variables de desarrollo, a excepción del tiempo de secado de aquenios y del porcentaje de semillas rudimentarias (p<0.05). El genotipo 1 (140.1 d) fue el material que tomó mayor tiempo en la sumatoria de las etapas de crecimiento y desarrollo (fase de floración). El genotipo 4 (127.2 d) fue el que presentó menores tiempos con diferencias significativas (p<0.05).

En relación con la producción de semilla sexual, la fertilización tuvo efecto significativo, al generar 2.14 veces más semillas (p<0.05) y, en general, incrementó el tiempo de las fases evaluadas en aproximadamente cinco días. Los genotipos 5 y 7 fueron los materiales con mayor producción de cabezuelas por plantas, mayor porcentaje de semillas llenas y mayor número de semillas por planta, lo que se asocia a su mayor número de ramas. De igual forma, se destaca el porcentaje de semillas vacías en todos los genotipos, así como de semillas rudimentarias, lo que conduce a que más de 30 % de las semillas no tengan viabilidad física.

En cuanto a la germinación (tabla 3), hubo diferencias significativas entre genotipos y tratamientos (p=0.000118). Como promedio, los porcentajes de germinación fueron 46.87, 53.53 y 25.97 % para el tratamiento testigo, uso de agua a 80 ºC y ácido sulfúrico, respectivamente, y este proceso inició a los tres días después de la siembra. La germinación de las semillas sin tratamiento fue significativamente menor en el genotipo 1 que en los otros seis genotipos (p<0.0001). Además, este mismo genotipo tuvo los valores más bajos, cuando se usó el tratamiento con agua y el de ácido sulfúrico, aunque no mostró diferencias significativas con los genotipos 2 y 7. La fertilización incrementó como promedio 9.2 % la germinación de los diferentes genotipos. El tratamiento que logró mayor germinación fue el uso de agua a 80 ºC, y el de menor germinación fue el que utilizó ácido sulfúrico. En general, los genotipos 3 y 6 fueron los que presentaron mayor porcentaje de germinación, pero solo tuvieron diferencias significativas ante el genotipo 1.