Plant material

Around 20 kg per plant of fresh leaves of A. occidentale, P. guajava, M. oleifera and M. citrifolia were collected in Granma province, Cuba, during the low rainy season of February/2019. This zone is characterized by a flat topography and brown soil with carbonates (Hernandez et al. 2019Hernández, A., Pérez, J. M., Bosch, D. & Castro, N. 2019. "La clasificación de suelos de Cuba: énfasis en la versión de 2015". Cultivos Tropicales, 40(1): 31, ISSN: 0258-5936.), authenticated by specialists from the Faculty of Agricultural Sciences of the University of Granma. The plants were more than one year old and without any pathology. The leaves were dried in the shade for five (A. occidentale, P. guajava and M. oleifera) and ten days (M. citrifolia), with free air circulation to constant weight and then dried in a stove (WSU 400, German) with air recirculation for 1 hour at 60 °C. Subsequently, the leaves were crushed in a hammer mill with parallel blades, at 1 mm of size. The samples were stored at room temperature of 26 °C, in fully airtight plastic bags until further use. In vitro experiments were performed at the Feed Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences to determine the antibacterial and antioxidant activity of the leaves and their aqueous extracts.

Preparation of the fine powder and aqueous extract

To obtain the fine powder, 5 kg per plant leaves were ground in a commercial grain crushing machine (Zhejiang Horus Industry and Trade Co., Ltd., Zhejiang, China) through a 40 mesh (0.45 mm) sieve (Yoston, China) and stored in completely airtight bags until use for microbiological tests. Also, 16.67 g of the leaves of each plant were weighed and mixed with 500 mL of water for aqueous extraction. The aqueous extract was obtained by the sonication method, using an ultrasonic extractor (model SY-1000E, China) for 50 minutes at 50 °C, allowed to stand for 1 hour, and filtered through Whatman filter paper No. 1. It was subsequently condensed through a rotary evaporator (model RE-2000, China), under reduced pressure at 45 °C at 60 rpm to reach an amount less than 10 mL of extract (Fieser 2004Fieser, L. 2004. Experiments of organic chemistry. Reverté editorial, first edition, pp. 269-275.). The extract was frozen at -80 °C for at least 4 hours, and finally dried in a lyophilizing machine (model LGJ-18, China).

Minimum bactericidal concentration of fine powder

The MBC of the fine powder from leaves of the four plants was determined for dilution method (Rios et al. 1988Rios, J.L., Recio, M.C., Villar, A. 1988. "Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of literature". Journal of Ethnopharmacology, 23(2-3): 127-149, ISSN: 0378-8741. https://doi.org/10.1016//0378-8741(88)90001-3.) in triplicate. For this, bacterial culture was prepared in culture medium at a concentration of approximately 15 x 10⁷ CFU/mL compared to theoretical optical density (550 nm absorbance) that defines the level of 0.5 in the McFarland turbidimetric scale, and was inoculated and incubated for 12 hours, later, 90 mm diameter Petri dishes were prepared with Mueller-Hinton Agar (MHA) at different concentrations of the fine powder. The concentration of the bacterial suspensions was adjusted to 0.5 (optical density) by using a spectrophotometer. Each bacterial culture of 100 µL was inoculated, which consisted in strains of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) K88+ and ATCC 1515, Staphylococcus aureus ATCC 43300 and ATCC 25923, Salmonella enteritidis: ATCC 3377, and Salmonella typhimurium ATCC 14028. In the first period, concentrations of 5, 15 and 30 mg/mL of fine powder in the culture medium were tested to identify the minimum concentration of each plant in that range for each bacterium tested. Then, concentrations less than 5.0 mg/mL (0.125, 0.25, 0.50, 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 mg/mL) were used for fine powder of leaves of A. occidentale against the six bacteria strains and same concentrations of fine powder of leaves of P. guajava against E. coli ATCC 1515, S. aureus ATCC 25923, S. enteritidis: ATCC 3377, and S. typhimurium ATCC 14028; concentrations of 5.0 to 15.0 mg/mL (5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0 and 15.0 mg/mL) of fine powder in culture medium for P. guajava against E. coli K88+ and S. aureus ATCC 43300 and for M. citrifolia against S. aureus ATCC 43300 and 25923; finally, 15 to 30 mg/mL of fine powder of culture medium with M. oleifera against S. aureus ATCC 43300 (Rios et al. 1988Rios, J.L., Recio, M.C., Villar, A. 1988. "Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of literature". Journal of Ethnopharmacology, 23(2-3): 127-149, ISSN: 0378-8741. https://doi.org/10.1016//0378-8741(88)90001-3.).

Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal of aqueous extract

For this study, microdilution method was used for MIC and dilution method for MBC of the aqueous extract (Rios et al. 1988Rios, J.L., Recio, M.C., Villar, A. 1988. "Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of literature". Journal of Ethnopharmacology, 23(2-3): 127-149, ISSN: 0378-8741. https://doi.org/10.1016//0378-8741(88)90001-3.). Stock solution of 13.0 mg/mL was prepared, which was used to prepare in serial dilutions of 13.0, 6.5, 3.25, 1.63, 0.81, 0.41, 0.2, 0.1, 0.05, 0.03, and 0.01 mg/mL. The inoculum of E. coli (ETEC) K88+, S. aureus ATCC 43300, and S. typhimurium ATCC 14028 were prepared in culture medium (Mueller Hinton Broth) at a concentration of approximately 15 x 10⁷ CFU/mL compared to theoretical optical density (550 nm absorbance) that defines the level of 0.50 in the McFarland turbidimetric scale. Then, 200 µL/well of each dilution was placed in 96-well microplates and 2 µL of each bacterial culture was inoculated for triplicates, incubated for 12 hours at 37 °C to determine its absorbance in a plate reader (ELISA, BIO-TEK, Synergy HT). Determination of the MBC was carried out for triplicated, 100 µL of supernatant from those wells where bacterial growth was inhibited and seeded with a sterile glass triangular spatula in 90 mm diameter Petri dishes with Mueller-Hinton Agar (MHA), and incubated for 12 hours at 37 °C.

Antioxidant activity of aqueous extract

For this study, leaves from the four plants were evaluated with 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH−) (Shen et al. 2010Shen, Q., Zhang, B., Xu, R., Wang, Y., Ding, X. & Li, P. 2010. "Antioxidant activity in vitro of selenium-contained protein from the Se-enriched Bifodobacterium animalis 01". Anaerobe, 16: 380-386, ISSN: 1075-9964. http://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2010.06.006. ), where a solution of 0.1 mM of DPPH− in methanol was prepared. Later, 1 mL of this solution was taken and vigorously mixed in a vortex with 3 mL of the different concentrations (10.0, 5.0, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 1,156, 0.078, 0.039, 0.020 and 0.010 mg/mL) of the extract, and 200 µL of each concentration were placed in a 96-well microplate. The solutions were left to stand at RT in the dark for 30 min and then, the absorbance at 517 nm was measured with the use of a plate reader (ELISA brand, BIO-TEK, Synergy HT). Butylated hydroxytoluene (BHT) was used as reference. Low absorbance values indicate high free radical scavenging capacity, or high antioxidant capacity, which was calculated using the following formula: Antioxidant effect of DPPH−(% inhibition) = [(A0 -A1) / A0 * 100], where A0 is the absorbance of the control reaction, and A1 is the absorbance in the presence of the extracts and the reference. Then, % of inhibition was plotted against concentration and the calibration curve for BTH was: y = 139.34x + 10.42, r² = 0.8672. All samples were evaluated in triplicate and the results were averaged and shown as IC₅₀ values (mg/mL).

Identification and quantification of major compounds from leaves of the four plants. pretreatment method

The sample leaves (around 40 mg) from A. occidentale, P. guajava, M. citrifolia and M. oleifera were added to 4 mL of extractant consisting in 0.8 mL of EDTA buffer solution + 3.2 mL of methanol, and were shaken under ultrasonic for 30 min. Then, centrifugation for 5 min to take the supernatant and the membrane was done. EDTA buffer solution consisted in 7.10 g of anhydrous sodium hydrogen phosphate, 1.95 g of disodium EDTA and 8.40 g of citric acid, dissolved in 650 mL of water.

Chromatographic method. ultra-high-performance liquid chromatography-MS/MS conditions

chromatographic analysis was performed on a waters acquity ultrahigh-performance liquid chromatography system, using an Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 column (3.0 x 150 mm, 1.8 μm). Mobile phase A: water (0.1% formic acid and 0.2 mmol/L ammonium acetate), mobile phase B: methanol (0.1% formic acid and 0.2 mmol/L ammonium acetate). Separation gradient (0-1 min: 10 % B, 1-2 min: 10 % B-60 % B, 2-7.5 min: 60 % B-90 % B, 7.5-8.0 min: 90 % B-100 % B, 8.0-8.1 min: 10 % B). The injection volume was 2 μL and the flow rate 0.30 mL/min (Fang et al. 2007Fang, F., Li, J., Pan, Q.-H. & Huang, W.-D. 2007. "Determination of red wine flavonoids by HPLC and effect of aging". Food Chemistry, 101(1): 428-433, ISSN: 0308-8146. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.12.036. ). MS was performed on a Sciex Triple Quad 4500 MS/MS, and electrospray ionization coupled with multiple reaction monitoring (MRM) model. The resulting optimized values were as follows: source temperature 450 °C, ion spray voltage 4500 V, collision gas: 9 psi, curtain gas 10 psi, ion source gas (GS 1) 18 psi, and ion source gas (GS 2) 0 psi. The corresponding declustering potential (DP) and collision energy (CE) are presented in table 1.

Statistical analysis

All analyzes are performed in triplicate. For the quantification of secondary metabolites, descriptive statistics were performed. Also, for the antioxidant test, data were processed by simple classification ANOVA in a completely randomized design. Before this, the normality of the data was verified using the Kolmogorov (1941)Kolmogorov, A. N. 1941. "On a logarithmic normal distribution law of the dimensions of particles under pulverization". Doklady Akademii Nauk Tadzhikskoi SSSR, 31(2): 99-101. and Smirnov (1948)Smirnov, N. 1948. "Table for estimating the goodness of fit of empirical distributions". Annals of mathematical statistics, 19(2): 297-281, ISSN: 2168-8990. http://doi.10.1214/amos/1177730256. test, and for uniformity of variance, the Bartlett test (1939)Bartlett, M. S. 1939. "A note of significance in multivariate analysis". Proceedings, Cambridge Philosophical Society, 35: 180-185.. In necessary cases, means using Duncan (1955)Duncan, D. B. 1955. "Multiple range and multiple F tests". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 1541-0420. http://doi.org/10.2307/3001478. test at the significance level of P<0.05 were separated. All analyzes were carried out in accordance with the IBM®SPSS® Statistics, version 22.0 (2013) (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Principal compounds from A. occidentale and P. guajava leaves

The content of principal compounds from A. occidentale and P. guajava leaves are shown on table 2, where it is observed the higher concentration of quercetin 3-O-glucoside-7-O-rhamnoside, kaempferol-7-O-glucoside, quercetin, caffeic acid and cinnamic acid from A. occidentale leaves compared to P. guajava.

Polyphenols are the major secondary metabolites distributed in all plants, with higher emphasis on isoflavonoids, anthocyanins, flavonols, and flavones in A. occidentale and P. guajava. The quantification of the main secondary metabolites in these two plants such as quercetin 3-O-glucoside-7-O-rhamnoside, chicoric acid, kaempeferol-7-O-glucoside, caffeic acid, and cinnamic acid could support the antibacterial and antioxidant effects found in this study. Theoretically, authors such as Roepke and Bozzo (2013)Roepke, J. & Bozzo, G. 2013. "Biocatalytic Synthesis of Quercetin 3-O-Glucoside-7-O-Rhamnoside by Metabolic Engineering of Escherichia coli". Chembiochem: European journal of chemical biology, 14(18): 2418-2422, ISSN: 1439-7633. http://doi.org/10.1002/cbic.201300474. have mentioned that 3-O-glucoside-7-O-rhamnoside is a rare secondary metabolite in plants with proven antioxidant and antimicrobial properties against E. coli. Furthermore, caffeic and chicoric acids have potential as antidiabetic agents, demonstrated by Mukhtar et al. (2004)Mukhtar, H., Ansari, S., Ali, M., Naved, T. & Bhat, Z. 2004. "Effect of water extract of Psidium guajava leaves on alloxan-induced diabetic rats". Die Pharmazie, 59(9): 734-735, ISSN: 0031-7144. who found a reduction in glucose concentration in laboratory mice when they used extracts of A. occidentale and P. guajava, respectively. In addition, the flavonoid kaempferol-7-O-glucoside was identified and quantified in the leaves of A. occidentale, which is a phytochemical widely studied for its antimicrobial properties (Singh et al. 2011Singh, D., Sharma, S., Rani, R., Mishra, S. & Sharma, R. A. 2011. "Kaempferol-7-o-glucoside and their antimicrobial screening isolate from Cassia renigera wall". International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 3(2): 30-34, ISSN: 0975-1556.).

Moreover, cinnamic acid is an organic acid that occurs naturally in many medicinal plants and quantified in both A. occidentale and P. guajava. This acid has low toxicity and a wide spectrum of functional activities, such as antibacterial, antiviral and antifungal properties (Sova 2012Sova, M. 2012. "Antioxidant and antimicrobial activities of cinnamic acid derivatives". Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 12(8): 749-767, ISSN: 1875-5607. http://doi.org/10.2174/138955712801264792. ), which supports the antimicrobial effect found in the leaves of the plant in study (tables 3 and 4). Although positive results have been found for the secondary metabolites quantified in the leaves of the plant under study (mainly A. occidentale), in farm animals, they are not conclusive. Thus, these results could contribute to understand how medicinal plants (mainly leaves of A. occidentale and P. guajava and their extracts), due to their antimicrobial and antioxidant function, can completely replace growth-promoting antibiotics in farm animals, as demonstrated by Martínez et al. (2013)Martínez, Y., Martínez, O., Liu, G., Ren, W., Rodríguez, R., Fonseca, Y., Olmo, C., Isert, M., Aroche, R., Valdivié, M. & Nyachoti, C. M. 2013. "Effect of dietary supplementation with Anacardium occidentale on growth performance and immune and visceral organ weights in replacement laying pullets". Journal of Food, Agriculture and Environment, 11(3 & 4): 1352-1357, ISSN: 1459-0255. , Más et al. (2016)Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Salazar, I., Aroche, R., López, B. & Marcella, D. 2016. "Efecto de la suplementación dietética con polvos de hojas de guayaba (Psidium guajava) y marañón (Anacardium occidentale) en el comportamiento productivo y la incidencia de diarrea en cerdos antes y después del destete". Revista Computadorizada de Producción Porcina, 23(2): 106-113, ISSN: 1026-9053. , Aroche et al. (2017)Aroche, R., Martínez, Y., Ayala, L., Rodríguez, R. & Rodríguez, Y. 2017. "Comportamiento productivo e incidencia de diarrea en cerdos posdestete suplementados con polvo mixto de hojas de plantas con propiedades nutracéuticas". Revista Ciencia y Agricultura, 14(2): 19-26, ISSN: 0122-8420. http://doi.org/10.19053/01228420.v14.n2.2017.7145. , Salazar et al. (2017)Salazar, I., Martínez, Y., Rodríguez, R., Olmo, C., Aroche, R., Pupo, G., Rosabal, O. & Más, D. 2017. "Efecto de la suplementación dietética con polvo mixto de plantas medicinales en la productividad y calidad del huevo de gallinas ponedoras". Revista de Producción Animal, 29(3): 1-5, ISSN: 2224-7920. and Aroche et al. (2018)Aroche, R., Martínez, Y., Ruan, Z., Guan, G., Waititu, S., Nyachoti, C. M., Más, D. & Lan, S. 2018. "Dietary Inclusion of a Mixed Powder of Medicinal Plant Leaves Enhances the Feed Efficiency and Immune Function in Broiler Chickens”. Journal of Chemistry, 2018: 1-6, ISSN: 2090-9063. http://doi.org/10.1155/2018/4073068. in poultry and pigs.

Antimicrobial activity of leaves powder and aqueous extract

The MBC of the leaf powder from the plants against six strains of pathogenic bacteria is showed in table 3. Leaf powder of A. occidentale showed the greatest bactericidal effect in the study, mainly against S. aureus ATCC 25923 and 43300 and S. typhimurium ATCC 14028, however, against E. coli K88+ concentration of 4 mg/mL was needed to inhibit the growth. Likewise, the leaf powder of P. guajava showed a bactericidal effect by reducing the growth of Gram-negative and Gram-positive bacteria, with the lowest concentration (1.0 mg/mL) for S. aureus ATCC 43300 and the highest concentration (11 mg/mL) for E. coli K88+. Also, the leaves of M. citrifolia and M. oleifera only showed bactericidal activity against the strains of S. aureus ATCC 43300 and ATCC 25923 although with higher doses (8 and 16 mg/mL respectively) than the inhibitory effects of the leaves of A. occidentale and P. guajava.

MIC and MBC of the aqueous extract of the leaves of the four plants in study are shown in table 4. Similar to the fine powder of the leaves, the aqueous extracts of A. occidentale and P. guajava had the highest bactericidal activity. It should be noted that MIC and MBC to inhibit the growth of E. coli K88+ is the same in both medicinal plants (6.5 mg/mL).

Likewise, a higher concentration of the aqueous extract of P. guajava (compared to the aqueous extract of A. occidentale leaves) is necessary to inhibit and eliminate S. typhimurium ATCC 14028, similar occurred for the bactericidal effect of this product against S. aureus ATCC 43300. The aqueous extract of M. citrifolia only inhibited the growth of S. aureus ATCC 43300 at doses of 6.5 mg/mL, however, it did not show bactericidal activity at the concentrations studied (maximum concentration of 13 mg/mL). Also, the M. oleifera extract did not show inhibitory or bactericidal activity.

A. occidentale is known for its antibacterial properties, mainly in its flowers, bark and leaves (da Silva et al. 2016da Silva, R. A., Liberio, S. A., do Amaral, F. M. M., Fernandes do Nascimento, F. R., Brandão Torres, L. M., Monteiro Neto, V. & Meireles Guerra, R. N. 2016. "Antimicrobial and antioxidant activity of Anacardium occidentale L. flowers in comparison to bark and leaves extracts". Journal of Biosciences and Medicines, 4: 87-99, ISSN: 2327-5081. http://dx.doi.org/10.4236/jbm.2016.44012. ). In addition, it has been used in the prevention and treatment of oral diseases (being the first contact of the digestive system with the food) by inhibiting the bacteria in this cavity and therefore the formation of biofilm (Anand et al. 2015Anand, G., Ravinanthan, M., Basaviah, R. & Shetty, V. 2015. "In vitro antimicrobial and cytotoxic effects of Anacardium occidentale and Mangifera indica in oral care". Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences, 7(1): 69-74, ISSN: 0976-4879. http://doi.org/10.4103/0975-7406.148780.). Also, Melo Menezes et al. (2014)Melo Menezes, K., Vieira Pereira, J., de Medeiros Nóbrega, D. R., Ramos de Freitas, A. F., Vieira Pereira, M. do S. & Vieira Pereira, A. 2014. "Antimicrobial and anti-adherent in vitro activity of tannins isolated from Anacardium occidentale Linn. (Cashew) on dental biofilm bacteria". Brazilian Research in Pediatric Dentistry and Integrated Clinic, 14(3): 191-198, ISSN: 1519-0501. http://dx.doi.org/10.4034/PBOCI.2014.143.03. found that both crude extract and isolated tannins of A. occidentale have inhibitory activity against microorganisms that are part of the composition of oral biofilm. Therefore, they hypothesized that the mechanisms of the antimicrobial action of tannins, the enzymatic inhibition, the modification of cellular metabolism by its action on the membranes and binding with metal ions, decrease the access to metabolism to the microorganisms that are outside the biofilm. The present study results showed a potent antimicrobial and antioxidant activity, which is related to the high content of polyphenols and flavonoids contained in its leaves, in addition to other medicinal compounds (Siracusa et al. 2020Siracusa, R., Fusco, R., Peritore, A. F., Cordaro, M., D’Amico, R., Genovese, T., Gugliandolo, E., Crupi, R., Smeriglio, A., Mandalari, G., Cuzzocrea, S., Di Paola, R. & Impellizzeri, D. 2020. "The Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties of Anacardium occidentale L. Cashew Nuts in a Mouse Model of Colitis". Nutrients, 12(3): 834, ISSN: 2072-6643, http://doi.org/10.3390/nu12030834.).

Souza et al. (2017)Souza, N. C., de Oliveira, J. M., Morrone, M. da S., Albanus, R. D., Amarante, M. do S. M., Camillo, C. da S., Langassner, S. M. Z., Gelain, D. P., Moreira, J. C. F., Dalmolin, R. J. S. & Pasquali, M. A. de B. 2017. "Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties of Anacardium occidentale Leaf Extract". Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM, 2017: 8, ISSN: 1741-427X. http://doi.org/10.1155/2017/2787308. observed the antioxidant and anti-inflammatory activity in vitro in A. occidentale leaves extract when used in RAW 264.7 macrophage cells due to the lower oxidative damage of these cells and the decrease in inflammatory parameters induced by lipopolysaccharides stimulation. Additionally, Brito et al. (2020)Brito, E., Mendes, L., Garruti, D., Zocolo, G. & Lima, M. 2020. "Structure Astringency Relationship of Anacardic Acids from Cashew Apple (Anacardium occidentale L.)". ChemRxiv, ISSN: 2573-2293. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.12336704., pointed out that pentagalloil hexoside, a precursor to the formation of hydrolyzed tannins such as ellagitannins and gallotanins, was found in all the organs of A. occidentale, these chemical compounds are responsible for several functional properties, with higher emphasis on the antimicrobial activity. Thus, the present study showed that A. occidentale was the plant with the highest antimicrobial and antioxidant capacity compared to the other three plants studied.

Regarding the effect of A. occidentale in animal production, specifically in poultry and pig production, Aroche et al. (2017)Aroche, R., Martínez, Y., Ayala, L., Rodríguez, R. & Rodríguez, Y. 2017. "Comportamiento productivo e incidencia de diarrea en cerdos posdestete suplementados con polvo mixto de hojas de plantas con propiedades nutracéuticas". Revista Ciencia y Agricultura, 14(2): 19-26, ISSN: 0122-8420. http://doi.org/10.19053/01228420.v14.n2.2017.7145. found that dietary supplementation with 1.0 % of a mixed powder made from 40 % of A. occidentale leaves powder increased growth performance and decreased the diarrhea incidence in weaned piglets. Furthermore, Más et al. (2016)Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Salazar, I., Aroche, R., López, B. & Marcella, D. 2016. "Efecto de la suplementación dietética con polvos de hojas de guayaba (Psidium guajava) y marañón (Anacardium occidentale) en el comportamiento productivo y la incidencia de diarrea en cerdos antes y después del destete". Revista Computadorizada de Producción Porcina, 23(2): 106-113, ISSN: 1026-9053. showed that the dietary inclusion in low concentrations of A. occidentale and P. guajava leaves powder promoted growth and reduced dehydration in pigs before and after weaning. In this sense, Aroche et al. (2018)Aroche, R., Martínez, Y., Ruan, Z., Guan, G., Waititu, S., Nyachoti, C. M., Más, D. & Lan, S. 2018. "Dietary Inclusion of a Mixed Powder of Medicinal Plant Leaves Enhances the Feed Efficiency and Immune Function in Broiler Chickens”. Journal of Chemistry, 2018: 1-6, ISSN: 2090-9063. http://doi.org/10.1155/2018/4073068. showed positive results in feed efficiency and IgG production when they added 0.5 % of a mixture of plants representing 60 % of A. occidentale in broiler diets.

P. guajava has also shown strong bactericidal activity on its leaves and aqueous extract, as it requires a small amount to eliminate bacteria such as E. coli, S. aureus, and Salmonella. Similarly, Salihu Abdallah et al. (2019)Salihu Abdallah, M., Nas, F. & Ali, M. 2019. "Antibacterial Activity of Psidium guajava Leaf and Stem Bark Extracts against Clinical Isolates of Staphylococcus aureus and Salmonella typhi". International Journal of Research in Pharmacy and Biosciences, 6(5): 11-17, ISSN: 2394-5893. verified that the aqueous and methanolic extracts of P. guajava leaves have antimicrobial activity against S. aureus and S. typhi. The aqueous extract was effective with MIC of 12.5 mg/mL for both bacteria and MBC between 25 and 50 mg/mL for S. aureus and S. typhimurium respectively. In this study, the concentrations of aqueous extract were necessary to obtain the MIC and MBC against these bacteria, and were lower than those, which may be due to the variety of the plant used, the origin, the extraction methods, among other factors. Also, Chero-Nepo and Ruiz-Barrueto (2016)Chero-Nepo, D.A. & Ruiz-Barrueto, M.Á. 2016. "Efecto antibacteriano in vitro del extracto alcohólico de Psidium guajava (guayaba) y Medicago sativa (alfalfa) sobre Streptococcus mutans ATCC 25175". Revista de Salud & Vida Sipanense, 3(2): 6-12, ISSN: 2313-0369. determined that the alcoholic extract of P. guajava inhibits the growth of Streptococcus mutans due to its bactericidal power.

Antioxidant activity of aqueous extract

Table 5 shows the IC₅₀ of the aqueous extract of the leaves of the four plants. A. occidentale plant with the highest free radical trapping activity compared to the other three plants, as it reflects the lower IC₅₀, being even lower (P<0.001) than the positive control BHT. Furthermore, P. guajava did not show (P>0.05) statistical differences with A. occidentale and BHT. However, M. oleifera and M. citrifolia had the lowest results in antioxidant activity, as they require the highest concentration to inhibit the DPPH− reaction.

Regarding the antioxidant activity, Flores et al. (2015)Flores, G., Wu, S.-B., Negrin, A. & Kennelly, E. J. 2015. "Chemical composition and antioxidant activity of seven cultivars of guava (Psidium guajava) fruits". Food Chemistry, 170: 327-335, ISSN: 0308-8146. identified the chemical composition of seven cultivars of P. guajava and founded a high content of flavonoids, in addition of anthocyanins, proanthocyanins, triterpenes and other compounds. Likewise, Feng et al. (2015)Feng, X., Wang, Z., Meng, D.-L. & Li, X. 2015. "Cytotoxic and antioxidant constituents from the leaves of Psidium guajava". Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 25: 2193-2198, ISSN: 0968-0896. http://dx.doi.org/10.1016/j.bmcl.2015.03.058. and Flores et al. (2015)Flores, G., Wu, S.-B., Negrin, A. & Kennelly, E. J. 2015. "Chemical composition and antioxidant activity of seven cultivars of guava (Psidium guajava) fruits". Food Chemistry, 170: 327-335, ISSN: 0308-8146. showed that there is high correlation between flavonoid content and the antioxidant capacity of the plant, which agree with our findings, where P. guajava was the second plant to show a high antioxidant power.

On the other hand, M. oleifera is a multipurpose plant with multiple nutritional benefits, but also has been studied for its antimicrobial and antioxidant effects, since its use in human and animal nutrition is increasingly popular (Wang et al. 2018Wang, P., Chen, T., Sun, J., Xu, Q. & Zhang, Y. 2018. "Research Progress in the Application of Moringa oleifera in Animal Feed". Chinese Journal of Animal Nutrition, 30(7): 2488-2495, ISSN: 1006-267X. http://doi.org/10.3969/j.issn.1006-267x.2018.07.008. ). Likewise, M. citrifolia has innumerable health benefits, however, when these two plants are compared with A. occidentale and P. guajava, they may be at a disadvantage due to the lower content of secondary metabolites responsible for the aforementioned activity. This research demonstrated the marked difference for antimicrobial and antioxidant effect of both the leaves and the aqueous extract of A. occidentale and P. guajava compared to M. citrifolia and M. oleifera.

However, in the case of M. oleifera, researchers such as Siddhuraju and Becker (2003)Siddhuraju, P. & Becker, K. 2003. "Antioxidant properties of various solvent extracts of total phenolic constituents from three different agroclimatic origins of drumstick tree (Moringa oleifera Lam.) leaves". Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(8): 2144-2155, ISSN: 0021-8561. http://doi.org/10.1021/jf020444. , determined that this plant presents high antioxidant power in its ethanolic and methanolic extracts, which was related to abundant flavonoid content, especially quercetin and kaempferol. Shih et al. (2011)Shih, M.C., Chang, C.M., Kang, S.M. & Tsai, M.L. 2011. "Effect of different parts (leaf, stem and stalk) and seasons (summer and winter) on the chemical compositions and antioxidant activity of Moringa oleifera". International Journal of Molecular Sciences, 12(9): 6077-6088, ISSN: 1422-0067. http://doi.org/10.3390/ijms12096077. found high antioxidant activity in the ethanolic extract of various parts of this plant, where the leaves showed the highest activity, with an IC₅₀ of 0.287 mg/mL, which is less than that found in this study (0.603 mg/mL). This difference could be due to the difference on the extraction (aqueous) method used this study. In relation to animal production, authors such as Zhang et al. (2018)Zhang, T., Zhang, B., Si, B., Zhang, N., Tu, Y., Zhou, C. & Diao, Q. 2018. "Effects of Moringa Leaf on Growth Performance, Slaughter Performance, Antioxidant Function and Meat Quality of Finishing Pigs". Chinese Journal of Animal Nutrition, 30(1): 255-261, ISSN: 1006-267X. http://doi.org/10.3969/j.issn.1006-267x.2018.01.031. found positive effects of M. oleifera on performance of fattening pigs, with a marked effect due to increased activity of the enzyme superoxide dismutase and decreased serum malondialdehyde concretion.

M. citrifolia only inhibited the growth of staphylococcal strains, in both forms, as fine powder and as aqueous extract, however, did not show any antimicrobial effect with the other bacterial strains. These results agree with Almeida et al. (2019)Almeida, É.S., Oliveira, D. de & Hotza, D. 2019. "Properties and Applications of Morinda citrifolia (Noni): A Review". Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 18(4): 883-909, ISSN: 1541-4337. http://doi.org/10.1111/1541-4337.12456., who reported several studies that probe the antimicrobial and antioxidant properties of M. citrifolia based on its chemical compounds in the plant parts. Also, antibacterial activity was found by Pandiselvi et al. (2019)Pandiselvi, P., Manohar, M., Thaila, M. & Sudha, A. 2019. Pharmacological activity of Morinda citrifolia L (Noni). In: Pharmacological benefits of natural products, First edition ed., India: JPS Scientific Publications, pp. 213-237, ISBN: 978-81-934054-2-0., specifically with Staphylococcus aureus. The difference in terms of the least antimicrobial effect in this study could be due to the use of methanolic extract. The antioxidant activity of the leaves of M. citrifolia was the lowest of among the four plants. Very little literature has been published about the antioxidant capacity of the leaves of this plant. Besides, there are several investigations that show this quality in its fruits (Senthilkumar et al. 2016Senthilkumar, S., Deepa, K., Suganya, T., Janakarajan, M., Muralidharan, J. & Vasanthakumar, P. 2016. "Therapeutic properties of noni (Morinda citrifolia) and its products". International Journal of Science, Environment and Technology, 5(3): 1496-1502, ISSN: 2278-3687. and Thorat et al. 2017Thorat, B., Kambale, A. & Patil, K. 2017. "Noni fruit crop is a versatile medicinal plant". Journal of Medicinal Plants Studies, 5(5): 247-249, ISSN: 2320-3862. ). Sunder et al. (2016)Sunder, J., Sujatha, T. & Kundu, A. 2016. "Effect of Morinda citrifolia in growth, production and immunomodulatory properties in livestock and poultry: a review". Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences, 4(3S): 249-265, ISSN: 2320-8694. http://doi.org/10.18006/2016.4(3S).249.265. demonstrated the multiple uses of M. citrifolia in livestock and poultry as a natural growth promoter due to its immunomodulatory, antioxidant, and hypocholesterolemic properties.

Material vegetal

Se recolectaron alrededor de 20 kg de hojas frescas por planta de A. occidentale, P. guajava, M. oleifera y M. citrifolia en la provincia de Granma, Cuba, durante la temporada de pocas lluvias de febrero/2019. Esta zona se caracteriza por una topografía plana y suelo pardo con carbonatos (Hernández et al. 2019Hernández, A., Pérez, J. M., Bosch, D. & Castro, N. 2019. "La clasificación de suelos de Cuba: énfasis en la versión de 2015". Cultivos Tropicales, 40(1): 31, ISSN: 0258-5936.), autenticado por especialistas de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Granma. Las plantas tenían más de un año y sin patología alguna. Las hojas se secaron a la sombra durante cinco (A. occidentale, P. guajava y M. oleifera) y diez días (M. citrifolia), con libre circulación de aire hasta peso constante y luego se secaron en estufa (WSU 400, alemán). con recirculación de aire durante 1 hora a 60 °C. Posteriormente, las hojas se trituraron en un molino de martillos de paletas paralelas, a 1 mm de tamaño. Las muestras se almacenaron a 26 °C de temperatura ambiente, en bolsas de plástico completamente herméticas hasta su uso posterior. Se realizaron experimentos in vitro en el Feed Research Institute de la Chinese Academy of Agricultural Sciences para determinar la actividad antibacteriana y antioxidante de las hojas y sus extractos acuosos.

Preparación del polvo fino y extracto acuoso

Para obtener el polvo fino, se molieron 5 kg de hojas de planta en una máquina trituradora de granos comercial (Zhejiang Horus Industry and Trade Co., Ltd., Zhejiang, China) a través de un tamiz de malla 40 mesh (0.45 mm) (Yoston, China) y se almacenaron en bolsas completamente herméticas hasta su uso para pruebas microbiológicas. Además, se pesaron 16.67 g de las hojas de cada planta y se mezclaron con 500 mL de agua para extracción acuosa. El extracto acuoso se obtuvo por el método de sonicación, con un extractor ultrasónico (modelo SY-1000E, China) durante 50 minutos a 50 °C, se dejó reposar durante 1 hora y se filtró a través de papel filtro Whatman No. 1. Posteriormente se condensó a través de un rotavapor (modelo RE-2000, China), bajo presión reducida a 45 °C a 60 rpm para alcanzar una cantidad menor a 10 mL de extracto (Fieser 2004Fieser, L. 2004. Experiments of organic chemistry. Reverté editorial, first edition, pp. 269-275.). El extracto se congeló a -80 °C durante al menos 4 horas y finalmente se secó en una máquina liofilizadora (modelo LGJ-18, China).

Concentración mínima bactericida de polvo fino

La CMB del polvo fino de las hojas de las cuatro plantas se determinó por el método de dilución (Rios et al. 1988Rios, J.L., Recio, M.C., Villar, A. 1988. "Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of literature". Journal of Ethnopharmacology, 23(2-3): 127-149, ISSN: 0378-8741. https://doi.org/10.1016//0378-8741(88)90001-3.) por triplicado. Para ello se preparó cultivo bacteriano en medio de cultivo a una concentración aproximada de 15 x 10⁷ UFC/mL frente a la densidad óptica teórica (550 nm de absorbancia) que define el nivel de 0.5 en la escala turbidimétrica de McFarland, y se inoculó e incubó durante 12 horas. Después se prepararon placas Petri de 90 mm de diámetro con Agar Mueller-Hinton (MHA) a diferentes concentraciones del polvo fino. La concentración de las suspensiones bacterianas se ajustó a 0.5 (densidad óptica) utilizando un espectrofotómetro. Se inoculó cada cultivo bacteriano de 100 µL, el cual consistió en cepas de Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) K88+ y ATCC 1515, Staphylococcus aureus ATCC 43300 y ATCC 25923, Salmonella enteritidis: ATCC 3377 y Salmonella typhimurium ATCC 14028. En el primer período, se probaron concentraciones de 5, 15 y 30 mg/mL de polvo fino en el medio de cultivo para identificar la concentración mínima de cada planta en ese rango para cada bacteria analizada. Luego, se utilizaron concentraciones menores a 5.0 mg/mL (0.125, 0.25, 0.50, 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 mg/mL) para polvo fino de hojas de A. occidentale contra las seis cepas de bacterias y las mismas concentraciones de polvo fino de hojas de P. guajava contra E. coli ATCC 1515, S. aureus ATCC 25923, S. enteritidis ATCC 3377 y S. typhimurium ATCC 14028; concentraciones de 5,0 a 15,0 mg/mL (5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0 and 15.0 mg/mL) de polvo fino en medio de cultivo para P. guajava contra E. coli K88+ y S. aureus ATCC 43300 y para M. citrifolia contra S. aureus ATCC 43300 y 25923. Finalmente, de 15 a 30 mg/mL de polvo fino de medio de cultivo con M. oleifera contra S. aureus ATCC 43300 (Rios et al. 1988Rios, J.L., Recio, M.C., Villar, A. 1988. "Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of literature". Journal of Ethnopharmacology, 23(2-3): 127-149, ISSN: 0378-8741. https://doi.org/10.1016//0378-8741(88)90001-3.).

Concentración mínima inhibidora y mínima bactericida del extracto acuoso

Para este estudio, se utilizó el método de microdilución para CMI y el método de dilución para CMB del extracto acuoso (Rios et al. 1988Rios, J.L., Recio, M.C., Villar, A. 1988. "Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of literature". Journal of Ethnopharmacology, 23(2-3): 127-149, ISSN: 0378-8741. https://doi.org/10.1016//0378-8741(88)90001-3.). Se preparó una solución madre de 13.0 mg/mL, que se utilizó para preparar diluciones seriadas de 13.0, 6.5, 3.25, 1.63, 0.81, 0.41, 0.2, 0.1, 0.05, 0.03 y 0.01 mg/mL. El inóculo de E. coli (ETEC) K88+, S. aureus ATCC 43300 y S. typhimurium ATCC 14028 se prepararon en medio de cultivo (Caldo Mueller Hinton) a una concentración de aproximadamente 15 x 10⁷ UFC/mL en comparación con la densidad óptica teórica (absorbancia de 550 nm) que define el nivel de 0.50 en la escala de McFarland. Luego, se colocaron 200 µL/pocillo de cada dilución en microplacas de 96 pocillos y se inocularon 2 µL de cada cultivo bacteriano por triplicado, se incubaron durante 12 horas a 37 °C para determinar su absorbancia en un lector de placas (ELISA, BIO-TEK, Synergy HT). La determinación del CMB se realizó por triplicado, 100 µL de sobrenadante de aquellos pocillos donde se inhibió el crecimiento bacteriano y se sembraron con una espátula triangular de vidrio estéril en placas de Petri de 90 mm de diámetro con Mueller-Hinton Agar (MHA), y se incubaron durante 12 horas a 37 °C.

Actividad antioxidante del extracto acuoso

Para este estudio, se evaluaron hojas de las cuatro plantas con 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH-) (Shen et al. 2010Shen, Q., Zhang, B., Xu, R., Wang, Y., Ding, X. & Li, P. 2010. "Antioxidant activity in vitro of selenium-contained protein from the Se-enriched Bifodobacterium animalis 01". Anaerobe, 16: 380-386, ISSN: 1075-9964. http://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2010.06.006. ), donde se preparó una solución de 0.1 mM de DPPH- en metanol. Posteriormente se tomó 1 mL de esta solución y se mezcló vigorosamente en un vortex con 3 mL de las diferentes concentraciones (10.0, 5.0, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 1,156, 0.078, 0.039, 0.020 y 0.010 mg/mL) del extracto, y 200 µL de cada concentración se colocaron en una microplaca de 96 pocillos. Las soluciones se dejaron reposar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min y luego se midió la absorbancia a 517 nm con el uso de un lector de placas (marca ELISA, BIO-TEK, Synergy HT). Se utilizó como referencia el hidroxitolueno butilado (BHT). Los valores bajos de absorbancia indican una alta capacidad eliminadora de radicales libres, o una alta capacidad antioxidante, que se calculó utilizando la siguiente fórmula: Efecto antioxidante del DPPH (% de inhibición) = [(A0-A1) /A0 * 100], donde A0 es la absorbancia de la reacción control, y A1 es la absorbancia en presencia de los extractos y la referencia. Luego, se ploteó el % de inhibición frente a la concentración y la curva de calibración para BHT fue: y = 139.34x + 10.42, r² = 0.8672. Todas las muestras se evaluaron por triplicado y los resultados se promediaron y se mostraron como valores de IC₅₀ (mg/mL).

Identificación y cuantificación de los principales compuestos de las hojas de las cuatro plantas. Método de pretratamiento

Las hojas de muestra (alrededor de 40 mg) de A. occidentale, P. guajava, M. citrifolia y M. oleifera se agregaron a 4 mL de extractante consistente en 0.8 mL de solución tampón EDTA + 3.2 mL de metanol y se agitaron bajo ultrasonido durante 30 min. Luego se centrifugó durante 5 min para tomar el sobrenadante y la membrana. La solución tampón EDTA estuvo compuesta por 7.10 g de fosfato monosódico anhidro, 1.95 g de EDTA disódico y 8.40 g de ácido cítrico, disueltos en 650 mL de agua.

Método cromatográfico. Condiciones de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-MS/MS.

El análisis cromatográfico se realizó en un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento Waters Acquity, utilizando una columna Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (3.0 x 150 mm, 1.8 μm). Fase móvil A: agua (0.1% de ácido fórmico y 0.2 mmol/L de acetato de amonio), fase móvil B: metanol (0.1% de ácido fórmico y 0.2 mmol/L de acetato de amonio). Gradiente de separación (0-1 min: 10 % B, 1-2 min: 10 % B-60 % B, 2-7.5 min: 60 % B-90 % B, 7.5-8.0 min: 90 % B-100 % B, 8.0-8.1 min: 10 % B). El volumen de inyección fue 2 μL y la velocidad de flujo fue de 0.30 mL/min (Fang et al. 2007Fang, F., Li, J., Pan, Q.-H. & Huang, W.-D. 2007. "Determination of red wine flavonoids by HPLC and effect of aging". Food Chemistry, 101(1): 428-433, ISSN: 0308-8146. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.12.036. ). La MS se realizó en un Sciex Triple Quad 4500 MS/MS y la ionización por electropulverización acoplada a un modelo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Los valores optimizados resultantes fueron los siguientes: temperatura de la fuente 450 °C, voltaje de pulverización de iones 4500 V, gas de colisión: 9 psi, gas de cortina 10 psi, gas de fuente de iones (GS 1) 18 psi y gas de fuente de iones (GS 2) 0 psi. El potencial de desagrupación (DP) y la energía de colisión (CE) correspondientes se presentan en la tabla 1.

Análisis estadístico

Todos los análisis se realizan por triplicado. Se realizó estadística descriptiva para la cuantificación de metabolitos secundarios. Además, para la prueba de antioxidantes, los datos se procesaron mediante ANOVA de clasificación simple en un diseño completamente al azar. Anteriormente, la normalidad de los datos se verificó mediante la prueba de Kolmogorov (1941)Kolmogorov, A. N. 1941. "On a logarithmic normal distribution law of the dimensions of particles under pulverization". Doklady Akademii Nauk Tadzhikskoi SSSR, 31(2): 99-101. y Smirnov (1948)Smirnov, N. 1948. "Table for estimating the goodness of fit of empirical distributions". Annals of mathematical statistics, 19(2): 297-281, ISSN: 2168-8990. http://doi.10.1214/amos/1177730256. , y la prueba de Bartlett (1939)Bartlett, M. S. 1939. "A note of significance in multivariate analysis". Proceedings, Cambridge Philosophical Society, 35: 180-185. se utilizó para la uniformidad de la varianza. En los casos necesarios, se separaron las medias utilizando la prueba de Duncan (1955)Duncan, D. B. 1955. "Multiple range and multiple F tests". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 1541-0420. http://doi.org/10.2307/3001478. al nivel de significancia de P<0.05. Todos los análisis se realizaron de acuerdo con IBM^® SPSS^® Statistics, versión 22.0 (2013) (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.).

Actividad antimicrobiana de polvo de hojas y extracto acuoso

La CMB del polvo de hojas de las plantas contra seis cepas de bacterias patógenas se muestra en la tabla 3. El polvo de hojas de A. occidentale mostró el mayor efecto bactericida en el estudio, principalmente contra S. aureus ATCC 25923 y 43300 y S. typhimurium ATCC 14028. Sin embargo, contra E. coli K88+ se necesitó una concentración de 4 mg/mL para inhibir el crecimiento. Asimismo, el polvo de hoja de P. guajava mostró efecto bactericida al reducir el crecimiento de bacterias Gram negativas y Gram positivas, siendo la concentración más baja (1.0 mg/mL) para S. aureus ATCC 43300 y la más alta (11 mg /mL) para E. coli K88+. Además, las hojas de M. citrifolia y M. oleifera sólo mostraron actividad bactericida frente a las cepas de S. aureus ATCC 43300 y ATCC 25923 aunque con dosis superiores (8 y 16 mg/mL, respectivamente) que los efectos inhibidores de las hojas de A. occidentale y P. guajava

La CMI y CMB del extracto acuoso de las hojas de las cuatro plantas esudiadas se muestran en la tabla 4. Al igual que el polvo fino de las hojas, los extractos acuosos de A. occidentale y P. guajava tuvieron la mayor actividad bactericida. Cabe señalar que la CMI y la CMB para inhibir el crecimiento de E. coli K88+ es la misma en ambas plantas medicinales (6.5 mg/mL).

Asimismo, es necesaria una mayor concentración del extracto acuoso de P. guajava (en comparación con el extracto acuoso de hojas de A. occidentale) para inhibir y eliminar la S. typhimurium ATCC 14028. Algo similar ocurrió para el efecto bactericida de este producto contra S. aureus ATCC 43300. El extracto acuoso de M. citrifolia solo inhibió el crecimiento de S. aureus ATCC 43300 con dosis de 6.5 mg/mL, pero no mostró actividad bactericida en las concentraciones estudiadas (concentración máxima de 13 mg/mL). Además, el extracto de M. oleifera no mostró actividad inhibidora ni bactericida.

A. occidentale es conocida por sus propiedades antibacterianas, principalmente en sus flores, corteza y hojas (da Silva et al. 2016da Silva, R. A., Liberio, S. A., do Amaral, F. M. M., Fernandes do Nascimento, F. R., Brandão Torres, L. M., Monteiro Neto, V. & Meireles Guerra, R. N. 2016. "Antimicrobial and antioxidant activity of Anacardium occidentale L. flowers in comparison to bark and leaves extracts". Journal of Biosciences and Medicines, 4: 87-99, ISSN: 2327-5081. http://dx.doi.org/10.4236/jbm.2016.44012. ). Además, se ha utilizado en la prevención y tratamiento de enfermedades bucales (siendo el primer contacto del sistema digestivo con los alimentos) al inhibir las bacterias de esta cavidad y por tanto la formación de biopelícula (Anand et al. 2015Anand, G., Ravinanthan, M., Basaviah, R. & Shetty, V. 2015. "In vitro antimicrobial and cytotoxic effects of Anacardium occidentale and Mangifera indica in oral care". Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences, 7(1): 69-74, ISSN: 0976-4879. http://doi.org/10.4103/0975-7406.148780.). De igual manera, Melo Menezes et al. (2014)Melo Menezes, K., Vieira Pereira, J., de Medeiros Nóbrega, D. R., Ramos de Freitas, A. F., Vieira Pereira, M. do S. & Vieira Pereira, A. 2014. "Antimicrobial and anti-adherent in vitro activity of tannins isolated from Anacardium occidentale Linn. (Cashew) on dental biofilm bacteria". Brazilian Research in Pediatric Dentistry and Integrated Clinic, 14(3): 191-198, ISSN: 1519-0501. http://dx.doi.org/10.4034/PBOCI.2014.143.03. encontraron que el extracto crudo y los taninos aislados de A. occidentale tienen actividad inhibidora contra los microorganismos que forman parte de la composición de la biopelícula oral. Por tanto, plantearon la hipótesis de que los mecanismos de acción antimicrobiana de los taninos, la inhibición enzimática, la modificación del metabolismo celular por su acción en las membranas y la unión con iones metálicos, disminuyen el acceso de los microorganismos que se encuentran fuera de la biopelícula al metabolismo. Los resultados del presente estudio mostraron una potente actividad antimicrobiana y antioxidante, la cual se relaciona con el alto contenido de polifenoles y flavonoides en sus hojas, además de otros compuestos medicinales (Siracusa et al. 2020Siracusa, R., Fusco, R., Peritore, A. F., Cordaro, M., D’Amico, R., Genovese, T., Gugliandolo, E., Crupi, R., Smeriglio, A., Mandalari, G., Cuzzocrea, S., Di Paola, R. & Impellizzeri, D. 2020. "The Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties of Anacardium occidentale L. Cashew Nuts in a Mouse Model of Colitis". Nutrients, 12(3): 834, ISSN: 2072-6643, http://doi.org/10.3390/nu12030834.).

Sousa et al. (2017)Souza, N. C., de Oliveira, J. M., Morrone, M. da S., Albanus, R. D., Amarante, M. do S. M., Camillo, C. da S., Langassner, S. M. Z., Gelain, D. P., Moreira, J. C. F., Dalmolin, R. J. S. & Pasquali, M. A. de B. 2017. "Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties of Anacardium occidentale Leaf Extract". Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM, 2017: 8, ISSN: 1741-427X. http://doi.org/10.1155/2017/2787308. observaron la actividad antioxidante y antiinflamatoria in vitro en extracto de hojas de A. occidentale cuando se usa en células de macrófagos RAW 264.7 debido al menor daño oxidativo de estas células y a la disminución de los indicadores inflamatorios inducidos por la estimulación de lipopolisacáridos. Además, Brito et al. (2020)Brito, E., Mendes, L., Garruti, D., Zocolo, G. & Lima, M. 2020. "Structure Astringency Relationship of Anacardic Acids from Cashew Apple (Anacardium occidentale L.)". ChemRxiv, ISSN: 2573-2293. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.12336704., señalaron que el hexósido de pentagaloil, precursor de la formación de taninos hidrolizados como elagitaninos y galotaninos, se encontró en todos los órganos de A. occidentale. Estos compuestos químicos son responsables de varias propiedades funcionales, con mayor énfasis en la actividad antimicrobiana. Así, el presente estudio demostró que A. occidentale fue la planta con mayor capacidad antimicrobiana y antioxidante comparada con las otras tres plantas estudiadas.

Respecto al efecto de A. occidentale en la producción animal, específicamente en la producción avícola y porcina, Aroche et al. (2017)Aroche, R., Martínez, Y., Ayala, L., Rodríguez, R. & Rodríguez, Y. 2017. "Comportamiento productivo e incidencia de diarrea en cerdos posdestete suplementados con polvo mixto de hojas de plantas con propiedades nutracéuticas". Revista Ciencia y Agricultura, 14(2): 19-26, ISSN: 0122-8420. http://doi.org/10.19053/01228420.v14.n2.2017.7145. encontraron que la suplementación dietética con 1.0 % de un polvo mixto elaborado con 40 % de polvo de hojas de A. occidentale aumentó el comportamiento del crecimiento y disminuyó la incidencia de diarrea en lechones destetados. Además, Más et al. (2016)Más, D., Martínez, Y., Rodríguez, R., Salazar, I., Aroche, R., López, B. & Marcella, D. 2016. "Efecto de la suplementación dietética con polvos de hojas de guayaba (Psidium guajava) y marañón (Anacardium occidentale) en el comportamiento productivo y la incidencia de diarrea en cerdos antes y después del destete". Revista Computadorizada de Producción Porcina, 23(2): 106-113, ISSN: 1026-9053. demostraron que la inclusión en la dieta de bajas concentraciones de polvo de hojas de A. occidentale y P. guajava promovió el crecimiento y redujo la deshidratación en cerdos, antes y después del destete. En este sentido, Aroche et al. (2018)Aroche, R., Martínez, Y., Ruan, Z., Guan, G., Waititu, S., Nyachoti, C. M., Más, D. & Lan, S. 2018. "Dietary Inclusion of a Mixed Powder of Medicinal Plant Leaves Enhances the Feed Efficiency and Immune Function in Broiler Chickens”. Journal of Chemistry, 2018: 1-6, ISSN: 2090-9063. http://doi.org/10.1155/2018/4073068. mostraron resultados positivos en la eficiencia alimenticia y la producción de IgG cuando agregaron 0.5 % de una mezcla de plantas que representa el 60 % de A. occidentale en dietas para pollos de engorde.

P. guajava también ha mostrado fuerte actividad bactericida en sus hojas y extracto acuoso, ya que requiere una pequeña cantidad para eliminar bacterias como E. coli, S. aureus y Salmonella. De manera similar, Salihu Abdallah et al. (2019)Salihu Abdallah, M., Nas, F. & Ali, M. 2019. "Antibacterial Activity of Psidium guajava Leaf and Stem Bark Extracts against Clinical Isolates of Staphylococcus aureus and Salmonella typhi". International Journal of Research in Pharmacy and Biosciences, 6(5): 11-17, ISSN: 2394-5893. comprobaron que los extractos acuoso y metanólico de hojas de P. guajava tienen actividad antimicrobiana contra S. aureus y S. typhi. El extracto acuoso fue efectivo con CMI de 12.5 mg/mL para ambas bacterias y CMB entre 25 y 50 mg/mL para S. aureus y S. typhimurium, respectivamente. En este estudio, las concentraciones de extracto acuoso fueron necesarias para obtener la CMI y CMB contra estas bacterias, y fueron inferiores a aquellas, lo que puede deberse a la variedad de planta utilizada, el origen, los métodos de extracción, entre otros factores. Además, Chero-Nepo y Ruiz-Barrueto (2016)Chero-Nepo, D.A. & Ruiz-Barrueto, M.Á. 2016. "Efecto antibacteriano in vitro del extracto alcohólico de Psidium guajava (guayaba) y Medicago sativa (alfalfa) sobre Streptococcus mutans ATCC 25175". Revista de Salud & Vida Sipanense, 3(2): 6-12, ISSN: 2313-0369. determinaron que el extracto alcohólico de P. guajava inhibe el crecimiento de Streptococcus mutans debido a su poder bactericida.

Actividad antioxidante del extracto acuoso

En la tabla 5 se muestra la IC₅₀ del extracto acuoso de las hojas de las cuatro plantas. La A. occidentale tuvo mayor actividad atrapadora de radicales libres en comparación con las otras tres plantas, ya que refleja la menor IC₅₀, siendo incluso menor (P<0.001) que el control positivo BHT. Además, P. guajava no mostró (P>0.05) diferencias estadísticas con A. occidentale y BHT. Sin embargo, M. oleifera y M. citrifolia tuvieron los resultados más bajos en actividad antioxidante, ya que requieren la concentración más alta para inhibir la reacción DPPH-.

En cuanto a la actividad antioxidante, Flores et al. (2015)Flores, G., Wu, S.-B., Negrin, A. & Kennelly, E. J. 2015. "Chemical composition and antioxidant activity of seven cultivars of guava (Psidium guajava) fruits". Food Chemistry, 170: 327-335, ISSN: 0308-8146. identificaron la composición química de siete cultivares de P. guajava y encontraron un alto contenido de flavonoides, además de antocianinas, proantocianinas, triterpenos y otros compuestos. Asimismo, Feng et al. (2015)Feng, X., Wang, Z., Meng, D.-L. & Li, X. 2015. "Cytotoxic and antioxidant constituents from the leaves of Psidium guajava". Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 25: 2193-2198, ISSN: 0968-0896. http://dx.doi.org/10.1016/j.bmcl.2015.03.058. y Flores et al. (2015)Flores, G., Wu, S.-B., Negrin, A. & Kennelly, E. J. 2015. "Chemical composition and antioxidant activity of seven cultivars of guava (Psidium guajava) fruits". Food Chemistry, 170: 327-335, ISSN: 0308-8146. demostraron que existe una alta correlación entre el contenido de flavonoides y la capacidad antioxidante de la planta, lo que concuerda con los hallazgos del presente estudio, donde P. guajava fue la segunda planta en mostrar un alto poder antioxidante.

Por otro lado, M. oleifera es una planta multipropósito con múltiples beneficios nutricionales, pero también se ha estudiado por sus efectos antimicrobianos y antioxidantes, ya que su uso en la nutrición humana y animal es cada vez más popular (Wang et al. 2018Wang, P., Chen, T., Sun, J., Xu, Q. & Zhang, Y. 2018. "Research Progress in the Application of Moringa oleifera in Animal Feed". Chinese Journal of Animal Nutrition, 30(7): 2488-2495, ISSN: 1006-267X. http://doi.org/10.3969/j.issn.1006-267x.2018.07.008. ). De la misma manera, la M. citrifolia tiene innumerables beneficios para la salud, sin embargo, cuando se comparan estas dos plantas con A. occidentale y P. guajava, pueden quedar en desventaja debido al menor contenido de metabolitos secundarios responsables de la actividad antes mencionada. Esta investigación demostró la marcada diferencia en el efecto antimicrobiano y antioxidante de las hojas y del extracto acuoso de A. occidentale y P. guajava en comparación con M. citrifolia y M. oleifera.

Sin embargo, en el caso de M. oleifera, investigadores como Siddhuraju y Becker (2003)Siddhuraju, P. & Becker, K. 2003. "Antioxidant properties of various solvent extracts of total phenolic constituents from three different agroclimatic origins of drumstick tree (Moringa oleifera Lam.) leaves". Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(8): 2144-2155, ISSN: 0021-8561. http://doi.org/10.1021/jf020444. , determinaron que esta planta presenta un alto poder antioxidante en sus extractos etanólico y metanólico, lo que se relacionó con abundante contenido de flavonoides, especialmente quercetina y kaempferol. Shih et al. (2011)Shih, M.C., Chang, C.M., Kang, S.M. & Tsai, M.L. 2011. "Effect of different parts (leaf, stem and stalk) and seasons (summer and winter) on the chemical compositions and antioxidant activity of Moringa oleifera". International Journal of Molecular Sciences, 12(9): 6077-6088, ISSN: 1422-0067. http://doi.org/10.3390/ijms12096077. encontraron alta actividad antioxidante en el extracto etanólico de varias partes de esta planta, donde las hojas mostraron la mayor actividad, con un IC₅₀ de 0.287 mg/mL, menor al encontrado en este estudio (0.603 mg/mL). Esta diferencia podría deberse a la diferencia en el método de extracción (acuoso) utilizado en este estudio. En relación con la producción animal, autores como Zhang et al. (2018)Zhang, T., Zhang, B., Si, B., Zhang, N., Tu, Y., Zhou, C. & Diao, Q. 2018. "Effects of Moringa Leaf on Growth Performance, Slaughter Performance, Antioxidant Function and Meat Quality of Finishing Pigs". Chinese Journal of Animal Nutrition, 30(1): 255-261, ISSN: 1006-267X. http://doi.org/10.3969/j.issn.1006-267x.2018.01.031. encontraron efectos positivos de la M. oleifera en el rendimiento de cerdos de engorde, con un efecto marcado debido al aumento de la actividad de la enzima superóxido dismutasa y la disminución de la concreción de malondialdehído sérico.

M. citrifolia sólo inhibió el crecimiento de cepas de estafilococos, en ambas formas, como polvo fino y como extracto acuoso, sin embargo, no mostró ningún efecto antimicrobiano con las otras cepas bacterianas. Estos resultados concuerdan con Almeida et al. (2019)Almeida, É.S., Oliveira, D. de & Hotza, D. 2019. "Properties and Applications of Morinda citrifolia (Noni): A Review". Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 18(4): 883-909, ISSN: 1541-4337. http://doi.org/10.1111/1541-4337.12456., quienes informaron sobre varios estudios que investigan las propiedades antimicrobianas y antioxidantes de M. citrifolia a partir de sus compuestos químicos en las partes de la planta. Además, Pandiselvi et al. (2019)Pandiselvi, P., Manohar, M., Thaila, M. & Sudha, A. 2019. Pharmacological activity of Morinda citrifolia L (Noni). In: Pharmacological benefits of natural products, First edition ed., India: JPS Scientific Publications, pp. 213-237, ISBN: 978-81-934054-2-0., encontraron actividad antibacteriana, específicamente con Staphylococcus aureus. La diferencia en términos del menor efecto antimicrobiano en este estudio podría deberse al uso de extracto metanólico. La actividad antioxidante de las hojas de M. citrifolia fue la más baja de las cuatro plantas. Se ha publicado muy poca literatura sobre la capacidad antioxidante de las hojas de esta planta. Además, existen varias investigaciones que demuestran esta calidad en sus frutos (Senthilkumar et al. 2016Senthilkumar, S., Deepa, K., Suganya, T., Janakarajan, M., Muralidharan, J. & Vasanthakumar, P. 2016. "Therapeutic properties of noni (Morinda citrifolia) and its products". International Journal of Science, Environment and Technology, 5(3): 1496-1502, ISSN: 2278-3687. y Thorat et al. 2017Thorat, B., Kambale, A. & Patil, K. 2017. "Noni fruit crop is a versatile medicinal plant". Journal of Medicinal Plants Studies, 5(5): 247-249, ISSN: 2320-3862. ). Sunder et al. (2016)Sunder, J., Sujatha, T. & Kundu, A. 2016. "Effect of Morinda citrifolia in growth, production and immunomodulatory properties in livestock and poultry: a review". Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences, 4(3S): 249-265, ISSN: 2320-8694. http://doi.org/10.18006/2016.4(3S).249.265. demostraron los múltiples usos de M. citrifolia en ganado y aves de corral como promotor natural del crecimiento debido a sus propiedades inmunomoduladoras, antioxidantes e hipocolesterolémicas.