In recent years, the inclusion of beneficial microorganisms in the fertilization strategies of agricultural crops has been of great interest, as an economically and ecologically viable alternative to improve the biological properties of soils, the efficiency of the use of nutrients and, consequently, reduce the use of mineral fertilizers (Sahgal and Srivastava 2020Sahgal, S. & Srivastava, D. 2020. "Utilization of Microbial Diversity as Biofertilizers". International Journal of Plant and Environment, 6 (3): 218-221, ISSN: 2455-202X. ).

Among these microorganisms is Gluconacetobacter diazotrophicus, an endophytic bacterium, with the ability to fix atmospheric nitrogen, stimulate plant growth and induce response mechanisms to biotic and abiotic stresses (El-Shouny et al. 2020El-Shouny, W. A., Shabanah, S., Fray, R. G., Narraidoo, N.& El-Ballat, E. M. 2020. "Endophytic colonization of tomato plants by Gluconacetobacter diazotrophicus and its effect on crops improvement and yield promotion". Delta Journal of Science, 41: 92 -106, ISSN: 2735-5306.). They have also showed their potential as biofertilizers and as protectors against pathogenic agents, the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), whose structures facilitate the absorption of nutrients and water, in addition to other benefits such as the solubilization of elements that are in the soil poorly available to plants (Chandrasekaran 2020Chandrasekaran, M. 2020. "A meta-analytical approach on arbuscular mycorrhizal fungi inoculation efficiency on plant growth and nutrient uptake". Agriculture, 10 (9): 1-12, ISSN: 2077-0472. https://doi.org/10.3390/agriculture10090370. ).

However to the previous, few studies deal with the effect of co-inoculation with both microorganisms, in terms of efficiency in the use of nutrients and crop yield, as well as in the reduction of mineral fertilizers. Studies on biofertilization with G. diazotrophicus, alone or combined with AMF, are also limited.

Based on these premises, this study makes a preliminary evaluation of the effect of simple and combined application of G. diazotrophicus bacterium and the AMF species Funneliformis mosseae on biomass production, the frequency of mycorrhizal colonization and the concentrations of N in the biomass of the aerial part of Guinea grass (Megathyrsus maximus cv. Likoni).

The study was carried out under semi-controlled conditions, at the Experimental Station of Pastures and Forages of Cascajal, located at 22° 39' North latitude and 80° 24' West longitude, in the Santo Domingo municipality, Villa Clara province, Cuba. Five treatments were studied, made up of simple and combined inoculation with G. diazotrophicus and F. mosseae, the application of nitrogenous fertilizer, at a rate of 25 mg N kg-1 of soil, and a control without biofertilizers or nitrogenous fertilization, in a completely random design with five repetitions.

The treatments were placed in plastic pots with a capacity of 3.5 L, previously perforated at the bottom to facilitate drainage. They were filled with 3 kg of soil, from the Station, classified as petroferric ferruginous nodular gley (Hernández et al. 2015Hernández, J. A.; Pérez, J.J. M.; Bosch, I. D., & Castro, S. N. Clasificación de los suelos de Cuba. Ediciones INCA, Cuba, 91 p. 2015. ISBN: 978-959-7023-77-7.). To fill the pots, the soil was taken to a depth of 0-20 cm and sieved with a 5-mm mesh. The soil pH in H₂O was strongly acidic (4.8), with low organic matter content (2.50 %), and very low assimilable P (5 mg kg^-1) and exchangeable K (0.13 cmol_c kg^-1).

For the application of G. diazotophicus, the commercial inoculant ICIBIOP-GLU, produced by the Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA) was used, with a concentration of 109 CFU mL-1. A solution composed of a mixture of the biofertilizer and water, in a 1:1 vv ratio, was prepared, where the seeds were immersed for 15 min. Subsequently, they were dried in the shade and sowing was carried out.

For the application of the mycorrhizal biofertilizer, the INCAM-2 strain of Funneliformis mosseae species (C. Walker & A. Schüßler), from the INCA collection, was used. The inoculum contained 30 spores per gram of substrate, as well as abundant fragments of rootlets from the host plant used to produce the inoculum (Urochloa decumbens), and a rate of 5 g per pot was applied.

For sowing, 15 guinea grass seeds (Megathyrsus maximus cv. Likoni) with 50 % germination were placed in holes 0.5 cm deep that were opened on the soil surface of each pot, close to the center, and later they were covered with the soil. In the treatments where F. mosseae was applied, the inoculant was deposited under the seeds at the time of sowing.

Eight days after sowing, a thinning was carried out and five plants per pot were left. Fertilization was immediately applied in all treatments, at a rate of 37 and 25 mg of P₂O₅ and K₂O kg^-1 of soil, equivalent to 25 and 50 kg ha^-1 of one and another nutrient, respectively. Triple superphosphate and potassium chloride were used as carriers. In the treatment corresponding to nitrogen fertilization, 25 mg of N kg^-1 of soil was applied, equivalent to 50 kg of N ha^-1, using urea as a carrier. Fertilizers were administered in a 2 cm deep circle around the set of plants, and covered with soil. The pots were watered every three days to maintain the soil at 80 % of field capacity.

The harvest was carried out 45 d after sowing. The green mass of the aerial and root parts of the plants was weighed, and both, after washing the roots to remove the remains of soil, were taken to an air circulation oven at 70 ºC for 72 h, to determine the yields of dry mass of the aerial part, roots and total dry mass (g pot^-1).The N concentrations in aerial biomass were calculated according to the manual of analytical techniques of Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) (Paneque et al. 2010Paneque, V. M.; Calaña, J. M.; Calderón, M.; Borges, Y.; Hernández, T. & Caruncho, M. 2010. Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos. Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, Mayabeque: Ediciones INCA. 153 pp, ISBN: 978-959-7023-51-7. https://docplayer.es/13119861-Manual-de-tecnicas-analiticas-para-analisis-de-suelo-foliar-abonos-organicos-y-fertilizantes-quimicos.html .). Rootlets were sampled at harvest time to determine the frequency of mycorrhizal colonization (Giovanetti and Mosse 1980Giovanetti, M. & Mosse, B. 1980. "An evaluation of techniques for measuring vesicular arbuscular mycorrhizal infection in roots". New Phytologist, 84: 489-500, ISSN: 1469-8137. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.1980.tb04556.x.). For statistical processing, the normality of the data was checked using the Kolmogorov-Smirnov test and the homogeneity of variances using the Levene test. When fulfilling both requirements, the analysis of variance was carried out on the original data. The mean values of the treatments were compared according to Tukey's test (P < 0.05). In all cases, the statistical program SPSS 25 (SPSS 2017SPSS. 2017. Statistical software, version 25. SPSS Institute. Chicago, Illinois. https://allpcworlds.com/download-ibm-spss-statistics-25-free-1/ .) was used.

G. diazotrophicus as well as F. mosseae increased the dry mass yields of the aerial, radical and total part of the grass. Among these treatments, the highest values corresponded to G. diazotrophicus. However, with the co-inoculation with both biofertilizers, values significantly higher than those reached for each one separately, and similar to those obtained with nitrogen fertilization, were recorded (table 1).

The frequency of mycorrhizal colonization significantly increased in the treatments inoculated with F. mosseae. However, the highest values were reached with the joint application of both biofertilizers (figure 1 a). The rest of treatments showed similar values to the control, without nitrogen or biofertilizers, which reflected the root occupation level of the AMF resident in the soil used in the experiment.

Regarding the concentrations of N in the biomass of the aerial part (figure 1 b), there was a similar effect to the biomass yields. That is: G. diazotrophicus as well as F. mosseae increased the values of this indicator. When comparing both treatments, the highest values corresponded to G. diazotrophicus. However, the joint application of biofertilizers produced significantly higher N concentrations than those obtained with the inoculation of one or the other separately, and similar to the treatment with nitrogenous fertilizer.

The positive effect of the inoculation with G. diazotrophicus on the yields of different agricultural crops has been reported by several authors, and they attribute it to its ability to fix atmospheric nitrogen and produce growth-stimulating phytohormones (Padwar et al. 2020Padwar, G., Mitra, N. G., Chand, T., Sahu, R. K. & Padwar, Ga. 2020. "Effect of microbial consortia as basal application and foliar spray of Gluconacetobacter diazotropicus on growth, yield and nutrient uptake by maize". International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 9 (6): 2900-2912, ISSN: 2319-7706. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2020.906.350.). The increase in the production of aerial and radical biomass, as well as the concentrations of N in the biomass, obtained in the biofertilization with this microorganism, seem to confirm such affirmations in the case of Guinea grass.

It has been shown that inoculation with effective strains of AMF increases mycorrhizal colonization levels, macronutrient concentrations and biomass yields in grasses, as a function of better use of soil nutrients and fertilizers (Silva et al. 2021Silva A., Mogollón, A. M. & Delgado, H. 2021. "Response of arbuscular mycorrhizal fungi and soil chemical properties to Brachiaria decumbens grass production technologies". Brazilian Archives of Biology and Technology, (64): 1-12, ISSN: 1678-4324. https://doi.org/10.1590/1678-4324-2021190323. ). But the most outstanding has been that with the joint application of both biofertilizers, guinea grass reached yields and N concentrations in the biomass of the aerial part, similar to those obtained with the application of nitrogenous fertilizer, especially in a soil with very low fertility and low organic matter content, indicative of a low availability of this nutrient.

This suggests an important contribution of G. diazotrophicus to the biological fixation of N, enhanced by co-inoculation with F. mosseae, from the synergistic effect of both microorganisms on plants. In this sense, Khan et al. (2020)Khan, A., Ding, Z., Ishaq, M., Khan, I., Ahme, A. A., Khan, A. Q. & Guo, X. 2020. "Applications of beneficial plant growth promoting rhizobacteria and mycorrhizae in rhizosphere and plant growth: A review". International Journal of Agricultural and Biological Engineering, 13 (5): 199-208, ISSN: 1934-6352. argued that this synergy is reflected in an increase in root growth and, in fact, in mycorrhizal colonization of the inoculated strain, whose activity in plants is stimulated by the biological fixation of N and the production of phytohormones by the bacterium; in addition, in a greater effectiveness of the bacteria from the photosynthates produced by the fungus.

It is concluded that joint inoculation with G. diazotrophicus and F. mosseae is effective in improving nitrogenous nutrition and aerial and root biomass yields of Megathyrsus maximus cv. Likoni. However, it is suggested to continue the studies on the joint application of both biofertilizers and their contribution to the reduction of the use of nitrogenous fertilizers in grasses.

En los últimos años ha sido de gran interés la inclusión de microorganismos benéficos en las estrategias de fertilización de los cultivos agrícolas, como una alternativa económica y ecológicamente viable para mejorar las propiedades biológicas de los suelos, la eficiencia del uso de los nutrientes y, consecuentemente, reducir el uso de fertilizantes minerales (Sahgal y Srivastava 2020Sahgal, S. & Srivastava, D. 2020. "Utilization of Microbial Diversity as Biofertilizers". International Journal of Plant and Environment, 6 (3): 218-221, ISSN: 2455-202X. ).

Entre estos microorganismos se encuentra Gluconacetobacter diazotrophicus, una bacteria endófita, con capacidad para fijar nitrógeno atmosférico, estimular el crecimiento vegetal e inducir mecanismos de respuesta ante estreses bióticos y abióticos (El-Shouny et al. 2020El-Shouny, W. A., Shabanah, S., Fray, R. G., Narraidoo, N.& El-Ballat, E. M. 2020. "Endophytic colonization of tomato plants by Gluconacetobacter diazotrophicus and its effect on crops improvement and yield promotion". Delta Journal of Science, 41: 92 -106, ISSN: 2735-5306.). También han demostrado sus potencialidades como biofertilizantes y como protectores ante agentes patógenos, los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA), cuyas estructuras facilitan la absorción de los nutrientes y el agua, además de otros beneficios como la solubilización de elementos que se encuentran en el suelo en formas poco disponibles para las plantas (Chandrasekaran 2020Chandrasekaran, M. 2020. "A meta-analytical approach on arbuscular mycorrhizal fungi inoculation efficiency on plant growth and nutrient uptake". Agriculture, 10 (9): 1-12, ISSN: 2077-0472. https://doi.org/10.3390/agriculture10090370. ).

No obstante a lo anterior, pocos trabajos abordan el efecto de la coinoculación con ambos microorganismos, en cuanto a la eficiencia en el uso de utrientes y el rendimiento de los cultivos, así como en la reducción de los fertilizantes minerales. También son escasos los estudios acerca de la biofertilización con G. diazotrophicus, sola o combinada con HMA.

A partir de estas premisas, en este trabajo se hace una evaluación preliminar del efecto de la aplicación simple y combinada de la bacteria G. diazotrophicus y la especie de HMA Funneliformis mosseae en la producción de biomasa, la frecuencia de colonización micorrízica y las concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea del pasto guinea (Megathyrsus maximus cv. Likoni).

El trabajo se realizó en condiciones semicontroladas, en la Estación Experimental de Pastos y Forrajes de Cascajal, ubicada a los 22° 39′ de latitud Norte y 80° 24′ de longitud Oeste, en el municipio de Santo Domingo, provincia Villa Clara, Cuba. Se estudiaron cinco tratamientos, conformados por la inoculación simple y combinada con G. diazotrophicus y F. mosseae, la aplicación de fertilizante nitrogenado, a razón de 25 mg N kg^-1 de suelo, y un testigo sin biofertilizantes ni fertilización nitrogenada, en un diseño completamente al azar con cinco repeticiones.

Los tratamientos de ubicaron en macetas de plástico de 3.5 L de capacidad, previamente perforadas en el fondo para facilitar el drenaje. Se llenaron con 3 kg de suelo, procedente de la propia Estación, clasificado como gley nodular ferruginoso petroférrico (Hernández et al. 2015Hernández, J. A.; Pérez, J.J. M.; Bosch, I. D., & Castro, S. N. Clasificación de los suelos de Cuba. Ediciones INCA, Cuba, 91 p. 2015. ISBN: 978-959-7023-77-7.). Para el llenado de las macetas, el suelo se tomó a una profundidad de 0-20 cm y se tamizó con malla de 5 mm. El pH del suelo en H₂O era fuertemente ácido (4.8), con bajo contenido de materia orgánica (2.50 %), y muy bajos de P asimilable (5 mg kg^-1) y K intercambiable (0,13 cmol_c kg^-1).

Para la aplicación de G. diazotophicus, se utilizó el inoculante comercial ICIBIOP-GLU, producido por el Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA), con una concentración de 10⁹ UFC mL^-1. Se preparó una solución compuesta por una mezcla del biofertilizante y agua, en relación 1:1 vv, donde se sumergieron las semillas durante 15 min. Posteriormente se secaron a la sombra y se procedió a la siembra.

Para la aplicación del biofertilizante micorrízico, se utilizó la cepa INCAM-2 de la especie Funneliformis mosseae (C. Walker & A. Schüßler), procedente de la colección del INCA. El inóculo contenía 30 esporas por gramo de sustrato, así como abundantes fragmentos de raicillas de la planta hospedera que se empleó para producir el inóculo (Urochloa decumbens), y se aplicó razón de 5 g por maceta.

Para la siembra, se colocaron 15 semillas de pasto guinea (Megathyrsus maximus vc. Likoni) con un 50 % de germinación, en orificios de 0.5 cm de profundidad que se abrieron en la superficie del suelo de cada maceta, próximos al centro, y que posteriormente se cubrieron con el propio suelo. En los tratamientos donde se aplicó F. mosseae, el inoculante de depositó debajo de las semillas en el momento de la siembra.

A los ocho días después de la siembra, se realizó un raleo y se dejaron cinco plantas por maceta. Inmediatamente se aplicó una fertilización en todos los tratamientos, a razón de 37 y 25 mg de P₂O₅ y K₂O kg^-1 de suelo, equivalentes a 25 y 50 kg ha^-1 de uno y otro nutriente, respectivamente. Se utilizaron como portadores superfosfato triple y cloruro de potasio. En el tratamiento correspondiente a la fertilización nitrogenada, se aplicó 25 mg de N kg^-1 de suelo, equivalente a 50 kg de N ha^-1, mediante el uso de urea como portador. Los fertilizantes se administraron en un círculo de 2 cm de profundidad alrededor del conjunto de plantas, y se cubrieron con el suelo. Las macetas se regaron cada tres días para mantener el suelo a 80 % de la capacidad de campo.

La cosecha se realizó a los 45 d posteriores a la siembra. Se pesó la masa verde de la parte aérea y radical de las plantas, y ambas después de lavadas las raíces para retirar los restos del suelo, se llevaron a una estufa de circulación de aire a 70 º C durante 72 h, para determinar los rendimientos de masa seca de la parte aérea, de raíces y de masa seca total (g maceta^-1). Se calcularon las concentraciones de N en la biomasa aérea, según el manual de técnicas analíticas del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) (Paneque et al. 2010Paneque, V. M.; Calaña, J. M.; Calderón, M.; Borges, Y.; Hernández, T. & Caruncho, M. 2010. Manual de técnicas analíticas para análisis de suelo, foliar, abonos orgánicos y fertilizantes químicos. Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, Mayabeque: Ediciones INCA. 153 pp, ISBN: 978-959-7023-51-7. https://docplayer.es/13119861-Manual-de-tecnicas-analiticas-para-analisis-de-suelo-foliar-abonos-organicos-y-fertilizantes-quimicos.html .). En el momento de la cosecha, se tomaron muestras de raicillas para determinar la frecuencia de colonización micorrízica (Giovanetti y Mosse 1980Giovanetti, M. & Mosse, B. 1980. "An evaluation of techniques for measuring vesicular arbuscular mycorrhizal infection in roots". New Phytologist, 84: 489-500, ISSN: 1469-8137. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.1980.tb04556.x.). Para el procesamiento estadístico se comprobó la normalidad de los datos mediante la dócima de Kolmogorov-Smirnov y la homogeneidad de varianzas por la dócima de Levene. Al cumplir ambos requisitos, se procedió a realizar el análisis de varianza a los datos originales. Los valores medios de los tratamientos se compararon según la prueba de Tukey (P < 0.05). En todos los casos, se utilizó el programa estadístico SPSS 25 (SPSS 2017SPSS. 2017. Statistical software, version 25. SPSS Institute. Chicago, Illinois. https://allpcworlds.com/download-ibm-spss-statistics-25-free-1/ .).

G. diazotrophicus como F. mosseae incrementaron los rendimientos de masa seca de la parte aérea, radical y total del pasto. Entre estos tratamientos, los valores más altos correspondieron a G. diazotrophicus. No obstante, con la coinoculación con ambos biofertilizantes, se registraron valores significativamente mayores a los alcanzados para cada uno por separado, y similares a los que se obtuvieron con la fertilización nitrogenada (tabla 1).

La frecuencia de colonización micorrízica aumentó significativamente en los tratamientos inoculados con F. mosseae. Sin embargo, los valores más altos se alcanzaron con aplicación conjunta de ambos biofertilizantes (figura 1 a). El resto de los tratamientos mostró valores similares al testigo, sin nitrógeno ni biofertilizantes, que reflejó el nivel de ocupación radical de los HMA residentes en el suelo utilizado en el experimento.

Con respecto a las concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea (figura 1 b), hubo efecto similar a los rendimientos de biomasa. Esto es: G. diazotrophicus como F. mosseae incrementaron los valores de este indicador. Al comparar ambos tratamientos, los mayores valores correspondieron a G. diazotrophicus. No obstante, la aplicación conjunta de los biofertilizantes produjo concentraciones de N significativamente mayores que las obtenidas con la inoculación de uno u otro por separado, y similares al tratamiento con fertilizante nitrogenado.

El efecto positivo de la inoculación con G. diazotrophicus en los rendimientos de diferentes cultivos agrícolas ha sido informado por varios autores, y lo atribuyen a su capacidad para fijar nitrógeno atmosférico y producir fitohormonas estimuladoras del crecimiento (Padwar et al. 2020Padwar, G., Mitra, N. G., Chand, T., Sahu, R. K. & Padwar, Ga. 2020. "Effect of microbial consortia as basal application and foliar spray of Gluconacetobacter diazotropicus on growth, yield and nutrient uptake by maize". International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 9 (6): 2900-2912, ISSN: 2319-7706. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2020.906.350.). El incremento de la producción de biomasa aérea y radical, así como de las concentraciones de N en la biomasa, obtenidas en la biofertilización con este microorganismo, parecen confirmar tales afirmaciones en el caso de la guinea.

Se ha demostrado que la inoculación con cepas efectivas de HMA incrementa los niveles de colonización micorrízica, las concentraciones de macronutrientes y los rendimientos de biomasa en los pastos, en función de un mejor aprovechamiento de los nutrientes del suelo y de los fertilizantes (Silva et al. 2021Silva A., Mogollón, A. M. & Delgado, H. 2021. "Response of arbuscular mycorrhizal fungi and soil chemical properties to Brachiaria decumbens grass production technologies". Brazilian Archives of Biology and Technology, (64): 1-12, ISSN: 1678-4324. https://doi.org/10.1590/1678-4324-2021190323. ). Pero lo más destacado ha sido que con la aplicación conjunta de ambos biofertilizantes, la guinea alcanzó rendimientos y concentraciones de N en la biomasa de la parte aérea, similares a los que se obtuvieron con la aplicación del fertilizante nitrogenado, sobre todo en un suelo con muy baja fertilidad y bajo contenido de materia orgánica, indicativos de una baja disponibilidad de este nutriente.

Lo anterior sugiere una contribución importante de G. diazotrophicus a la fijación biológica de N, potenciada por la coinoculación con F. mosseae, a partir del efecto sinérgico de ambos microorganismos en las plantas. En este sentido, Khan et al. (2020)Khan, A., Ding, Z., Ishaq, M., Khan, I., Ahme, A. A., Khan, A. Q. & Guo, X. 2020. "Applications of beneficial plant growth promoting rhizobacteria and mycorrhizae in rhizosphere and plant growth: A review". International Journal of Agricultural and Biological Engineering, 13 (5): 199-208, ISSN: 1934-6352. argumentaron que dicha sinergia se refleja en un incremento del crecimiento de las raíces y, de hecho, de la colonización micorrízica de la cepa inoculada, cuya actividad en las plantas se estimula por la fijación biológica del N y la producción de fitohormonas por parte de la bacteria; además, en una mayor efectividad de la bacteria a partir de los fotosintatos producidos por el hongo.

Se concluye que la inoculación conjunta con G. diazotrophicus y F. mosseae resulta efectiva para mejorar la nutrición nitrogenada y los rendimientos de biomasa aérea y radical de Megathyrsus maximus cv. Likoni. No obstante, se sugiere continuar los estudios acerca de la aplicación conjunta de ambos biofertilizantes y su contribución a la reducción del uso de fertilizantes nitrogenados en los pastos.