Location of the experiment. The experiment began on September 19, 2019 in an experimental plot belonging to the Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus, Cuba (21^o 53´ 00´´ north latitude and 79^o 21´ 25´´ west longitude, altitude 40 m o.s.l).

Plant material. Morus alba Linn (Moraceae), Yu-62 variety, from the germplasm bank of the Sancti Spíritus Experimental Station was evaluated.

Bacterial strain. The INICA-8 strain, from Azospirillum brasilense, provided by the Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes (IIPF) was applied. According to the manufacturer's recommendations, the preparation was diluted in common water, in a ratio of 1:10. The inoculation was performed at the time of transplantation of mulberry seedlings, with an inoculum of 10⁹-10¹⁰ CFU /mL. A 12 L sprayer backpack was used, whose content was dropped on the soil around the seedling. When regulating the spout, each plant approximately received 125 mL of liquid inoculum (40 L/ha of pure inoculum).

Strain of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF). The inoculation was performed using the EcoMic^® certified mycorrhizal inoculant, which contained 30 spores/g of substrate produced in the Departamento de Biofertilizantes y Nutrición from INCA. It was applied solid in the soil around the plant (15-20 g/plant), immediately after transplanting the seedling, with a dose equivalent to 50 kg/ha.

Fertilization with organic matter. A mixture of soil and organic matter (3: 1 ratio) was applied, in a dose equivalent to 30 t/ha, whose composition is shown in table 1.

Chemical fertilization. Phosphoric carrier (P₂O₅) was applied in doses of 30 g/plant, equivalent to 100 kg/ha, amount recommended for mulberry (Cifuentes and Sohn 1998Cifuentes, C. A. & Sohn, K. W. 1998. Manual tácnico de sericulture: cultivo de la morera y cría del gusano de seda en el trópico. Convenio SENA-CDTS. Colombia. 348p.).

Agrotechnics of the experiment. It was performed from September 19, 2019 to April 15, 2020, in an area of 40 x 40 m, destined to mulberry sowing in seedlings to obtain green forage. A conventional soil preparation was carried out: plowing, medium harrow, light harrow, crossing, recrossing and furrowing. A 1 x 0.5 m frame was used, with a sowing density of 20,000 pl/ha, for a total of 3,200 plants in the experimental area. Root ball seedlings were used, which were sown at a depth of 10 cm. Irrigation (250 m³/ha) was applied three times in September (once during the transplanting of seedlings, and two immediately after inoculation). It was not irrigated in October because this month there was rainfalls that guaranteed sufficient soil moisture. However, it was irrigated three times in November, and twice in December, January, February, March, and April, respectively.

Evaluation of the climatic variables in the area and experimental period. The variables rainfalls (mm), temperature (^oC) and relative humidity (%) were evaluated. The data were provided by the Delegación Provincial del Instituto de Meteorología (INSMET) in Sancti Spíritus.

Basic agrochemical composition of the experimental soil. The soil in the experimental area (table 2) corresponded to the loose brown carbonate type (Hernández et al. 2015Hernández, A, Pérez, J.M., Bosh, D. & Castro, N. 2015. Clasificación de los suelos de Cuba. 1^st Ed. Ed. Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, González, O. (ed.). San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, p. 93, ISBN: 978-959-7023-77-7.), made of brown or slightly dark brown clay, with a slight reaction to HCL. It has some gravels on the A1 horizon, good superficial and internal drainage, moderately erodible.

Experimental design and statistical analysis. An experimental design of control plots was used (Lerch 1977Lerch, G. 1977. La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas. Ed. Científico-Técnica. La Habana, Cuba, p. 452.), with six treatments and ten replications (table 3). The differences between means were determined by Fisher's LSD (Fernández et al. 2010Fernández, R., Trapero, A. & Domínguez, J. 2010. Experimentación en agricultura. Consejería de Agricultura y Pesca. Servicio de Publicaciones y Divulgación. Sevilla, Andalucía, España, ISBN: 978-84-8474-281-4.). The digit count data were transformed by√x. The statistical program StatGraphics Centurion XV (Anon, 2007Anon.2007. Statgraphics Centurion XV. Dyna 82(1):7. ) was used.

Evaluated variables. The variables length and the main stem diameter, number of branches and leaves and dry weight of leaves were measured.

To determine the main stem length (MST, cm), it was measured from the stem base to the apex, using a tape measure. Six evaluation moments were taken into account, days after sowing (DAS) (45, 75, 105, 135 and 165 DAS).

The main stem diameter (MSD, cm) was measured at the cutting time, 20 cm from the stem base, with a vernier.

To determine the dry weight of leaves (DWL, g), they were placed in a MEMMERT oven, at a temperature of 70 ^oC, for seven days. Subsequently, the weighing was performed on an OHAUS technical digital scale, with 1 kg capacity.

The inoculation efficiency index (IEI, %) was determined, according to the Santillana et al. (2012)Santillana, N., Zúñiga, D. & Arellano, C. 2012. "Capacidad promotora del crecimiento en cebada (Hordeum vulgare) y potencial antagónico de Rhizobium leguminosarum y Rhizobium etli". Agrociencia Uruguay, 16(2): 11-17, ISSN: 2301-1548. formula:

Figure 1 shows the rainfalls during the period September/2019-April/2020. Abundant rainfalls characterized September and October 2019. However, in the period from December 2019 to April 2020 they were very low in December, January, February, March and April. In this interval, important phenological stages of the crop occurred, which coincided with a very low level of rainfalls.

As shown in figure 2, the highest average temperatures in the experimental period occurred in September 2019 and April 2020, months in which the sown and cut of the experiment was made. The maximum temperatures reached their highest values also in these intervals, while the minimum temperatures were recorded in December 2019 and January 2020.

Figure 3 shows that the highest value of relative humidity was registered in October 2019, while the lowest was in April 2020. In the latter, the experiment cut was made.

At 15 DAS, the INICA-8 treatment (51.90 cm) showed higher values (P <0.001) than the AC (40.30 cm) and EcoMic^® (44.40 cm), although it was equal to the FCOM (52.63 cm) and to EcoMic^® + INICA -8 (47.80 cm). However, it was lower than P₂O₅FC (62.30 cm) (figure 4).

At 45 DAS, P₂O₅FC (86.12 cm), as well as FCOM (90.15 cm) were higher (P <0.001) to the absolute control (67.06 cm), while they showed letters equal to the three inoculated treatments. The latter showed statistically equal values among themselves and with respect to the absolute control (figure 4).

At 75 DAS, the P₂O₅FC (141.40 cm) reached higher values (P <0.001) than the rest of the treatments, with the exception of FCOM (119.50 cm). EconoMic^® (118.40 cm), INICIA-8 (111.05 cm) and EconoMic^® + INICA-8 (97.79 cm) were statistically equal, but only EcoMic^® and INICA-8 were higher to AC (figure 4).

At 105 DAS, P₂O₅FC (193.90 cm) showed higher values (P <0.001) than the rest of the treatments, while EcoMic^® + INICA-8 (167.10 cm) and FCOM (158.50 cm), although they shared common letters with INICA-8 (154.60 cm), were higher to EcoMic^® (140.30 cm) and AC (130.60 cm) (figure 4).

At 135 DAS, P₂O₅FC (206.20 cm) showed higher values (P <0.001) than the rest of the treatments, except for EcoMic^® + INICA-8 (190.40 cm), with it was statistically similar. The latter, in turn, shared common letters with EcoMic^® (182.33 cm), and was higher to INICA-8 (167.00 cm), FCOM (164.70 cm) and AC (156.33 cm) (figure 4).

At the time of cutting (165 DAS), EcoMic^® + INICA-8 (213.33 cm) showed superiority (P <0.001) in relation to INICA-8 (186.90 cm) and AC (174.90 cm), although it shared common letters with EcoMic^® (196.00 cm) and with FCOM (195.90 cm), being only lower to the chemically fertilized control (257.69 cm).

The results obtained in this experiment show the superiority of the inoculated treatments with respect to AC in all the stages that were evaluated, where the combination of Glomus cubense with Azospirillum highlighted in the last three measurements (105 DAS, 135 DAS and 165 DAS). This superiority of the inoculants with respect to the control in these phases could be due to the synergistic effect of the Glomus cubense strain, which was applied in combination with the INICA-8 strain of Azospirillum brasilense. However, there was also a higher effect with respect to AC by each of the inoculants that were applied in a simple way in the first three measurements (15 DAS, 45 DAS and 75 DAS). However, these treatments did not exceed the fertilized controls.

The association of AMF with different mulberry genotypes can facilitate the adsorption of nitrogen and phosphorus by the plant (Ambika et al. 1994Ambika, P.K., Das, P.K., Katiyar, R.S. & Choudhury, P.C. 1994. "The influence of vesicular arbuscular mycorrhizal association on growth, yield and nutrient uptake in some mulberry genotypes (Morus spp.)". Indian Journal of Sericulture, 33: 166-169, ISSN: 0445-7722.). Likewise, the application of Azospirillum brasilense can reduce the requirements of nitrogen fertilizers, such as urea, which contributes to lower costs in mulberry (Das et al. 1994Das, P.K., Choudhury, P.C., Ghosh, A., Katiyar, R.S., Rao, G.R.M., Mathur, V.B., Mazamder, M.K. & Madhava-Rao, Y.R. 1994. "Studies on the effect of bacterial biofertilizers in irrigated mulberry (Morus alba L.) ". Indian Journal of Sericulture, 33(2): 170, ISSN: 0445-7722.).

Sánchez de la Cruz et al. (2008)Sánchez de la Cruz, R., Díaz-Franco, A., Pecina-Quintero, V., Garza-Cano, I. & Loera-Gallardo, J. 2008. "Nota científica: Glomus intraradices y Azospirillum brasilense en trigo bajo dos regímenes de humedad en el suelo". Universidad y Ciencia, 24(3): 239-245, ISSN: 0186-2979. found that in greenhouse experiments the simple inoculation of G. intraradices, as well as A. brasilense, increased the plant height in wheat. However, the combination of these microorganisms did not exert a perceptible effect on the studied variables, despite there is a constant regulated humidity regime, which contradicts what was obtained in this experiment. It is possible that mechanisms specifically associated with the plant family, and not with the synergy of these microorganisms, influence on these divergent results. Shaimaa and Massoud (2017)Shaimaa, A.M. & Massoud, O.N. 2017. "Impact of Inoculation with Mycorrhiza and Azotobacter under Different N and P Rates on Growth, Nutrient status, Yield and Some Soil Characteristics of Washington Navel Orange Trees". Middle East Journal of Agriculture, 6(3): 617-638, ISSN: 2706-7955., when inoculating a combination of Azotobacter and AMF in orange, observed a synergism that was reflected in the plants growth, in the extraction of N, P and K in leaves, and in the yield.

In this experiment, the superior response of plants to the application of chemical fertilizer coincides with that reported by Baqual and Das (2006)Baqual, M.F. & Das, P.K. 2006. "Influence of Biofertilizers on Macronutrient uptake by the Mulberry Plant and its Impact on Silkworm Bioassay". Caspian Journal of Environmental Sciences, 4(2): 98-109, ISSN: 1735-3033., who state that mulberry responds well to the application of nitrogen fertilizer as phosphoric.

Figure 5 shows the significantly higher effect of the treatment inoculated with EcoMic^® (1.70 cm) with respect to the rest of the treatments (P <0.001), although it shared common letters with the CFC (1.60 cm). In turn, the combination EcoMic^® + INICA-8 (1.50 cm) was higher to INICA-8 (1.33 cm) and the absolute control (1.23 cm), and shared common letters with the two fertilized controls.

The results obtained in this variable show a marked influence of the inoculation with AMF, in a simple way as in combination with Azospirillum. However, the treatment inoculated only with AMF higlighted, which coincides with that reported by Pentón et al. (2011)Pentón, G., Reynaldo, I., Martín, G.J., Rivera, R. & Oropesa, K. 2011. "Uso del EcoMic^® y el producto bioactivo Pectimorf^® en el establecimiento de dos especies forrajeras". Pastos y Forrajes, 34(3): 281-294, ISSN: 2078-8452. in an experiment with mulberry cuttings in a nursery.

Through the symbiosis that is established between AMF and plants, the absorption of some nutrients that are difficult to move in the soil (P, Fe, among others) is increased, due to the action of the external mycelium of AMF, linked to the plants root systems, and to the higher absorption of water, N, K and some micronutrients (Sanclemente et al. 2018Sanclemente, O.E., Sánchez de Prager, M., Prager, M. 2018. "Prácticas agroecológicas, micorrización y productividad del intercultivo maíz-soya (Zea mays L.- Glycine max L.)". Idesia (Arica), 36(2): 217-224, ISSN: 0718-3429, DOI: http://dx.doi.org/10.4067/S0718-34292018005000301.). This type of root branching also benefits the absorption of nutrients by increasing the root surface (Ruiz-Lozano 2016Ruiz-Lozano, J.M., Aroca, R., Zamarreño, A.M., Molina, S., Andreo-Jiménez, B., Porcel, R., García-Mina, J.M., Ryter-Spira, C. & López-Ráez, J.A. 2016. "Arbuscular mycorrhizal symbiosis induces strigolactone biosynthesis under drought and improves drought tolerance in letuce andtomato". Plant, Cell & Environment, 39(2): 441-452, ISSN: 1365-3040, DOI: https://doi.org/10.1111/pce.12631.). The AMFs improve the extraction of nutrients from the soil and their efficiency (Bitterlich and Franken 2016Bitterlich, M. & Franken, P. 2016. "Connecting polyphosphate translocation and hyphal water transport points to a key of mycorrhizal functioning". The New Phytologist, 211(4): 1147-1149, ISSN: 1469-8137, Available: https://www.jstor.org/stable/newphytologist.211.4.1147.), which brings with it greater exports of these.

Padma et al. (2000)Padma, S.D., Sukumar, J. & Nagendrakumar, T.D. 2000. "Mycorrhizal association in mulberry". Bulletin of Materials Science, 4(2): 18-25, ISSN: 0250-4707. , when referring to the mycorrhizal symbiotic fungi that colonize the bark of mulberry roots, highlighted their important role in the efficiency of phosphorus mobilization and in the availability of a group of micronutrients, as well as in growth and plant development.

Several studies show that communities of diverse bacteria associated with AMF enhance mycorrhization and plant growth (Agnolucci et al. 2015Agnolucci, M., Battini, F., Cristani, C. & Giovannetti, M. 2015. "Diverse bacterial communities are recruited on spores of different arbuscular mycorrhizal fungal isolates". Biology and Fertility of Soils, 51(3): 379-389, ISSN: 1432-0789, DOI: https://doi.org/10.1007/s00374-014-0989-5.). This interaction between AMF-bacteria increases the colonization of both microorganisms in the host, because it increases the germination and growth of endophyte hyphae and increases the population of bacteria in the rhizosphere of plants in the presence of AMF (Fernández et al. 2016Fernández, B.L., Colombo, R., Bompadre, J., Benavides, M., Scorza, V., Silvani, V., Pergola, M. & Godeas, A. 2016. "Cultivable bacteria associated with infective propagules of arbuscular mycorrhizal fungi. Implications for mycorrhizal activity". Applied Soil Ecology, 105: 86-90, ISSN: 0929-1393, DOI: https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2016.04.013. and Long et al. 2017Long, L., Lin, Q., Yao, Q. & Zhu, H. 2017. "Population and function analysis of cultivable bacteria associated with spores of arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora margarita. 3" Biotech, 7(1): 8, ISSN: 2190-5738, DOI: https://doi.org/10.1007/s13205-017-0612-1.). However, the stimulation of plant growth in the presence of arbuscular mycorrhizal fungi does not necessarily have to be associated with the solubilization of elements that are not very mobile in the soil or at low concentrations. Mechanisms such as the production of phytohormones, vitamins or amino acids can be linked to the effects of these microorganisms (Siqueira 2010Siqueira, J.O. 2010. Micorrizas: 30 años de pesquisas no Brasil. Ed. UFLA. Lavras, Minas Gerais, Brasil, p. 716.).

Figure 6 shows the significant superiority (P <0.001) of the treatment inoculated with EcoMic^® + INICA-8 (2.96) with respect to the rest, especially with AC (1.70). The treatments inoculated in a simple way (EcoMic^® and INICA-8) shared common letters with the FCOM (2.42) and with the P₂O₅FC (2.25).

The role of beneficial microorganisms in the development of agroproductive variables in mulberry is also evident in the number of branches. It is known that Azospirillum can also solubilize phosphates, which offers to the plant an important nutrient that has a positive effect on different physiological parameters (Tahir et al. 2013 Tahir, M., Mirza, M.S., Zaheer, A., Dimitrov, M.R., Smidt, H. & Hameed, S. 2013. "Isolation and identification of phosphate solubilizer Azospirillum, Bacillus and Enterobacter strains by 16SrRNA sequence analysis and their effect on growth of wheat (Triticum aestivum L.) ". Australian Journal of Crop Science, 7(9): 1284-1292, ISSN: 1835-2693. ). However, in this study, there was superiority in the results derived from the combination of the bacteria with respect to AMF. According to Aguirre-Medina (2008)Aguirre-Medina, F. 2008. Biofertilizantes microbianos: Antecedentes del programa y resultados de validación en México. In: La Biofertilización como Tecnología Sostenible. 1^st Ed. Díaz-Franco, A. & Mayek-Pérez, N. (eds). Ed. Plaza y Valdés, S.A. de C.V. México, D.F., México, p. 257, ISBN: 978-970-722-706-4., the simultaneous combination of growth-promoting rhizobacteria and arbuscular mycorrhizal fungi induces synergism, which is reflected in an increase in growth, phosphorus content in plants, and yield with respect to the plants separately inoculated. Abd-Alla et al. (2014)Abd-Alla, M.H., El-Enany, A.W.E., Nafady, N.A., Khalaf, D.M. & Morsy, F.M. 2014. "Synergistic interaction of Rhizobium leguminosarum bv. viciae and arbuscular mycorrhizal fungi as a plant growth promoting biofertilizers for faba bean (Vicia faba L.) in alkaline soil". Microbiological Research, 169(1): 49-58, ISSN: 1618-0623, DOI: https://doi.org/10.1016/j.micres.2013.07.007. and Bona et al. (2017)Bona, E., Cantamessa, S., Massa, N., Manassero, P., Marsano, F., Copetta, A., Lingua, G., D’Agostino, G., Gamalero, E. & Berta, G. 2017. "Arbuscular mycorrhizal fungi and plant growth-promoting pseudomonads improve yield, quality and nutritional value of tomato: a field study". Mycorrhiza, 27(1): 1-11, ISSN: 1432-1890, DOI: https://doi.org/10.1007/s00572-016-0727-y. consider that the result of the tripartite mutualistic symbiosis between AMF-bacteria-host is the increase in the development of the plant, since it increases its capacity to absorb more water and nutrients from the soil, such as nitrogen, phosphorus, potassium and microelements.

Various authors refer to results similar to that of this experiment, although with other beneficial microorganisms. Nithya et al. (2011)Nithya, D., Poornima, S.M., Pazhani-Murugan, R., Gopikrishnan, V., Radhakrishnan, M., Bhivi, D. & Balagurunathan, R. 2011. "Influence of biofertilizers and irrigation systems for the growth and yield of mulberry plants". International Journal of Plant, Animal and Environmental Sciences, 1(3): 93-99, ISSN: 2231-4490. reported that in a study with mulberry, when inoculating the plants with a solubilizing phosphate bacteria and the beneficial fungus Aspergillus spp., the stem length was increased, as well as the number of branches and leaves. Abdel-Rahman et al. (2011)Abdel-Rahman, S.S., Abdel-Kader, A.A. & Khalil, S.E. 2011. "Response of three sweet basil cultivars to inoculation with Bacillus subtilis and arbuscular mycorrhizal fungi under salt stress conditions". Nature and Science, 9(6): 93-111, ISSN: 2375-7167. found that the effect of the co-inoculation of G. irradicans and Bacillus subtilis increased the height and number of branches of three varieties of basil, which surpassed the treatments where only each microorganism was inoculated.

Figure 7 highlights the significant superiority (P <0.001) of the EcoMic^® + INICA-8 (10.76) combined treatment with respect to the rest, with the exception of P₂O₅FC (10.28). The control fertilized with organic matter (9.22) was superior to INICA-8 (6.45), to AC (6.03) and EcoMic^® (5.90). These last three did not differ from each other.

In this study, the combined effect of Glomus cubense and Azospirillum brasilense was the inoculated treatment that had the most significant influence on the results of this variable, as it was statistically equal to P₂O₅FC. According to Fernández and Rodríguez (2005)Fernández, M.T. & Rodríguez, H. 2005. "El papel de la solubilización de fósforo en los biofertilizantes microbianos". ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, 39(3): 27-34, ISSN: 0138-6204. , the mycorrhizosphere is the rhizosphere of a mycorrhizal plant, and it is in it where interactions with beneficial microorganisms with specific functions and interactions with pathogens take place. In many cases, the established interactions are positive, in which a synergism effect is recorded, where the AMF and the other microorganism produce growth increased, vigor and protection of the plant.

It is also known that the availability of P in soils is important for nitrogen absorption and its use in plants (Vafadar et al. 2014Vafadar, F., Amooaghaie, R. & Otroshy, M. 2014. "Effects of plant-growth-promoting rhizobacteria and arbuscular mycorrhizal fungus on plant growth, stevioside, NPK, and chlorophyll content of Stevia rebaudiana". Journal of Plant Interactions, 9(1): 128-136, ISSN: , DOI: https://doi.org/10.1080/17429145.2013.779035.). Therefore, more P available due to its solubilization by the inoculated AMF could lead to a better absorption of N or nitrogen fixation by Azospirillum, which would lead to an increase in the values of its variables as in the number of leaves. The co-inoculation of AMF-Azospirillum sp is an example of beneficial interaction, since the colonization of the roots by fungi stimulates the flow of carbohydrates from the canopy to the root, which can constitute sources of carbon for the bacteria growth (Costacurta 1995Costacurta, A. 1995. "Genetic studies on the auxin hypothesis in the Azospirillum/plant inoculation". Dissertationes de Agricultura, 275: 34-39, ISSN: 0772-1285. ).

Figure 8 shows that both EcoMic^® + INICA-8 (78.51g/plant) and FCOM (76.79 g/plant) were significantly higher to the rest of the treatments (P <0.001) and statistically similar to each other. The P₂O₅FC (64.97 g/plant) was higher to EcoMic^® (36.60 g/plant), the absolute control (30.10 g /plant) and INICA-8 (29.02 g/plant).

In this experiment, the DWL is the most important variable from the agronomic point of view, since it constitutes the basis of the mulberry forage production potential. Sudhakar et al. (2000)Sudhakar, P., Chattopadhyay, G.N., Gangwar, S.K. & Ghosh, J. K. 2000. "Effect of foliar application of Azotobacter, Azospririllum and Beijerinkia on leaf yield and quality of mulberry (Morus alba) ". The Journal of Agricultural Science, 134(2): 227-234, ISSN: 1469-5146, DOI: https://doi.org/10.1017/S0021859699007376. reported on the advantages of the application of bacterial biofertilizers in the production of leaves in this crop. Baqual and Qayoom (2004)Baqual, M.F. & Qayoom, S. 2004. "Biofertilizers and promises that they bold". Indian Silk, 43(3): 15-16, ISSN: 0019-6355., when applying Azotobacter and Azospirillum indistinctly to mulberry plants, observed an increase in the production of leaves and other variables. However, in this study , only the combination of Glomus cubense and A. brasilense led higher dry weight of leaves, with values similar to those of the application of organic fertilizer. Therefore, it is evident that the synergistic action of both microorganisms increased the number of leaves and other variables studied here.

The marked difference between the treatments in which the AMF and Azospirillum are combined with the control could be due to the amount of P absorbed by the plants due to the effect of the AMF applied. This hypothesis is supported by different authors who corroborate that mycorrhizae take up phosphates in the soil more efficiently through their hyphae that increase the volume of explored soil (Smith et al. 2011Smith, S.E., Jakobsen, I., Gronlund, M. & Smith, F.A. 2011. "Roles of arbuscular mycorrhizas in plant phosphorus nutrition: interactions between pathways of phosphorus uptake in arbuscular mycorrhizal roots have important implications for understanding and manipulating plant phosphorus acquisition". Plant Physiology, 156(3): 1050-1057, ISSN: 1532-2548, DOI: https://doi.org/10.1104/pp.111.174581.). Valerio (2016)Valerio, S.D. 2016. Respuesta morfofisiológica y expresión de genes Pht1 de cuatro cultivares de Zea mays L., inoculados con hongos micorrízicos arbusculares bajo dos concentraciones de fósforo inorgánico. MSc. Thesis. La Paz, Baja California Sur, México, p. 101. confirmed that the inoculation of corn with Claroideo glomus etunicatum leads to a significant increase in leaf area and dry weight of leaves.

Umakanth and Bagyaraj (1998)Umakanth, C.G. & Bagyaraj, D.J. 1998. "Response of mulberry saplings to inoculation with VA Mycorrhizal Fungi and Azotobacter". Sericologia, 38(4): 669-675, ISSN: 0250-3980. observed that the double inoculation of S34 mulberry in nursery (suitable for dry areas) with Glomus fasciculatum and the diazotrophic bacterium Azotobacter chroococcum led to a considerable increase in plant growth and development. According to Bellone and de Bellone (2012)Bellone C.H. & de Bellone, S.C. 2012. "Interaction of Azospirillum brasilense and Glomus intrarradix in Sugar Cane Roots". Indian Journal of Microbiology, 52(1): 70-75, ISSN: 0973-7715, DOI: https://doi.org/10.1007/s12088-011-0208-0., the combination with Glomus and Azospirillum helps sugarcane to improve nitrogen availability and absorption in plants, which increases its biomass.

According to Ram Rao et al. (2007)Ram-Rao, D.M., Kodandaramaiah, J., Reddy, M.P., Katiyar, R.S. & Rahmathulla, V.K. 2007. "Effect of VAM fungi and bacterial biofertilizers on mulberry leaf quality and silkworm cocoon characters under semiarid conditions". Caspian Journal of Environmental Sciences, 5(2): 111-117, ISSN: 1735-3033., the combined inoculation of G. mosseae with A. chroococcum in mulberry showed its higher effect from the agronomic and economic point of view, with the improvement of soil fertility, quality of leaves, among other variables. Vafadar et al. (2014)Vafadar, F., Amooaghaie, R. & Otroshy, M. 2014. "Effects of plant-growth-promoting rhizobacteria and arbuscular mycorrhizal fungus on plant growth, stevioside, NPK, and chlorophyll content of Stevia rebaudiana". Journal of Plant Interactions, 9(1): 128-136, ISSN: , DOI: https://doi.org/10.1080/17429145.2013.779035. reported that the dual inoculation of G. intraradices and A. chroococcum increased the dry weight of Stevia rebaudiana leaves. According to these authors, the ability of AMF to solubilize phosphorus in the roots ensures the bacteria a continuous fixation of atmospheric nitrogen, a process that could be one of the causes of the results obtained in this experiment.

The higher effect of organic fertilization on this variable is highlighted here. This result contradicts what was reported by Bello et al. (2011)Bello, R., García, M., Martínez, V. & Abeledo, C. 2011. "Effect of two organic fertilizers on the cultivation of mulberry (Morus alba) trees". Revista Computadorizada de Producción Porcina, 18(3): 203-206, ISSN: 1026-9053. about that the application of organic sources does not always benefit mulberry cultivation, especially when poor quality compost is used. This could show that the organic matter used in this experiment is of high quality.

Figure 9 shows that the IEI that predominated in this variable was the one obtained in the combined inoculation of EcoMic^® + INICA-8 (160.8 %), while the inoculation with EcoMic^® was lower, but with positive values (21.98 %). Also, the simple application of INICA-8 was not efficient.

From the results of the inoculation efficiency calculation, a higher effect of the combination of the applied microorganisms can be seen. The simple application of Glomus cubense, and especially that of Azospirillum brasilense, did not exert a positive effect on the weight of leaves. This inefficiency of Azospirillum could be due to antagonistic factors that could affect the survival of the bacteria or its capacity as PGPR. These factors include the physical-chemical conditions of the soil, the genotype of the host and the ability of the bacteria to establish and compete with the native microflora (Pecina-Quintero et al. 2005Pecina-Quintero, V., Díaz-Franco, A., Williams-Alanís, H., Rosales-Robles, E. & Garza-Cano, I. 2005. "Influencia de fecha de siembra y biofertilizantes en sorgo". Revista Fitotecnia Mexicana, 28(4): 389-392, ISSN: 0187-7380. ).

The interaction between AMF and bacteria increases the populations of both microorganisms in the rhizosphere of plants, which stimulates an increase in the volume of roots. This allows higher absorption of water and nutrients, in addition to increasing phosphorus solubilization, nitrogen fixation and resistance induction. In addition, tolerance to abiotic factors is improved, among others (Meng et al. 2015Meng, L., Zhang, A., Wang, F., Han, X., Wang, D. & Li, S. 2015. "Arbuscular mycorrhizal fungi and rhizobium facilitate nitrogen uptake and transfer in soybean/maize intercropping system". Frontiers in Plant Science, 6: 1-10, ISSN: 1664-462X, DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2015.00339.). Bécquer et al. (2019)Bécquer, C.J., Reyes, R., Fernández, D., González, P.J. & Medinilla, F. 2019. "Rendimiento de pasto Mulato II inoculado con Bradyrhizobium sp. y Glomus cubense, en condiciones de sequía agrícola". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(3): 319-330, ISSN: 2079-3480. reported that the combined inoculation of G. cubense and Bradyrhizobium sp. in mulatto grass II, it resulted in an IEI of the aerial biomass higher than that obtained with the other forms of simple inoculation of these microorganisms.

It is concluded that the combined inoculation of EcoMic^® + INICA-8 exerted a higher effect on the studied variables. The variables that were most favored with the inoculation were the stem length and the number of branches. Simple inoculation of INICA-8 was inefficient in all variables.

It is recommended to evaluate the selected treatments in other field tests with Morus alba in different edaphoclimatic conditions and in various cuts, as well as to evaluate the inclusion of different levels of organic matter in the combinations of inoculants in Morus alba.

Localización del experimento. El experimento se inició el 19 de septiembre del 2019 en una parcela experimental perteneciente a la Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus en Cuba (21^o 53´ 00´´ de latitud norte y los 79^o 21´ 25´´ de longitud oeste, altura de 40 m s.n.m.).

Material vegetal. Se evaluó Morus alba Linn. (Moraceae), variedad Yu-62, procedente del banco de germoplasma de la Estación Experimental Sancti Spíritus.

Cepa bacteriana. Se aplicó la cepa INICA-8, de Azospirillum brasilense, proporcionada por el Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes (IIPF). Según recomendaciones del fabricante, el preparado se diluyó en agua común, en proporción de 1:10. La inoculación se realizó en el momento del trasplante de las posturas de morera, con un inóculo de 10⁹-10¹⁰ UFC/mL. Se utilizó una mochila aspersora de 12 L, cuyo contenido se echó en el suelo alrededor de la postura. Al regular el surtidor, cada planta recibió aproximadamente 125 mL del inóculo líquido (40 L/ha de inóculo puro).

Cepa de hongos micorrízicos arbusculares (HMA). La inoculación se realizó mediante el inoculante micorrízico certificado ECOMIC^®, que contenía 30 esporas/g de sustrato producido en el Departamento de Biofertilizantes y Nutrición del INCA. Se aplicó en forma sólida en el suelo alrededor de la planta (15-20 g/planta), inmediatamente después del trasplante de las posturas, con una dosis equivalente a 50 kg/ha.

Fertilización con materia orgánica. Se aplicó una mezcla de suelo y materia orgánica (proporción 3:1), en dosis equivalente a 30 t/ha, cuya composición se muestra en la tabla 1.

Fertilización química. Se aplicó portador fosfórico (P₂O₅) en dosis de 30 g/planta, equivalente a 100 kg/ha, cantidad recomendada para la morera (Cifuentes y Sohn 1998Cifuentes, C. A. & Sohn, K. W. 1998. Manual tácnico de sericulture: cultivo de la morera y cría del gusano de seda en el trópico. Convenio SENA-CDTS. Colombia. 348p.).

Agrotecnia del experimento. Se realizó desde el 19 de septiembre de 2019 hasta el 15 de abril del 2020, en un área de 40 x 40 m, destinada a la siembra de morera en posturas para la obtención de forraje verde. Se realizó una preparación convencional del suelo: roturación, grada mediana, grada ligera, cruce, recruce y surcado. Se empleó un marco de 1 x 0.5 m, con densidad de siembra de 20 000 pl/ha, para un total de 3 200 plantas en el área experimental. Se utilizaron posturas en cepellón, que se sembraron a una profundidad de 10 cm. Se aplicó riego (250 m³/ha) tres veces en septiembre (una vez durante el trasplante de las posturas, y dos inmediatamente después de la inoculación). No se regó en octubre porque en este mes se presentaron precipitaciones que garantizaron la suficiente humedad del suelo. No obstante, sí se regó tres veces en noviembre, y dos en diciembre, enero, febrero, marzo y abril, respectivamente.

Evaluación de las variables climáticas en el área y período experimental. Se evaluaron las variables precipitaciones (mm), temperatura (^oC) y humedad relativa (%). Los datos fueron facilitados por la Delegación Provincial del Instituto de Meteorología (INSMET) en Sancti Spíritus.

Composición agroquímica básica del suelo experimental. El suelo del área experimental (tabla 2) correspondió al tipo pardo mullido carbonatado (Hernández et al. 2015Hernández, A, Pérez, J.M., Bosh, D. & Castro, N. 2015. Clasificación de los suelos de Cuba. 1^st Ed. Ed. Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, González, O. (ed.). San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, p. 93, ISBN: 978-959-7023-77-7.), de arcilla parda o pardo ligeramente oscuro, con reacción ligera al HCL. Presenta algunas gravas en el horizonte A1, buen drenaje superficial e interno, medianamente erosionable.

Diseño experimental y análisis estadístico. Se utilizó un diseño experimental de parcelas testigo (Lerch 1977Lerch, G. 1977. La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas. Ed. Científico-Técnica. La Habana, Cuba, p. 452.), con seis tratamientos y diez réplicas (tabla 3). Las diferencias entre medias se determinaron por LSD de Fisher (Fernández et al. 2010Fernández, R., Trapero, A. & Domínguez, J. 2010. Experimentación en agricultura. Consejería de Agricultura y Pesca. Servicio de Publicaciones y Divulgación. Sevilla, Andalucía, España, ISBN: 978-84-8474-281-4.). Los datos de conteo de dígitos se transformaron por √x. Se utilizó el programa estadístico StatGraphics Centurion XV (Anon 2007Anon.2007. Statgraphics Centurion XV. Dyna 82(1):7. ).

Variables evaluadas. Se midieron las variables longitud y diámetro del tallo principal, número de ramas y hojas, y peso seco de las hojas.

Para determinar la longitud del tallo principal (LTP, cm) se midió desde la base del tallo hasta el ápice, utilizando una cinta métrica. Se tomaron en cuenta seis momentos de evaluación, días después de la siembra (DDS) (45, 75, 105, 135 y 165 DDS).

El diámetro del tallo principal (DTP, cm) se midió en el momento del corte, a 20 cm de la base del tallo, con un calibrador pie de rey.

Para determinar el peso seco de las hojas (PSH, g), estas se colocaron en una estufa MEMMERT, a 70 ^oC de temperatura, durante siete días. Posteriormente, se efectuó el pesaje en una balanza digital técnica OHAUS, de 1 kg de capacidad.

Se determinó el índice de eficiencia de la inoculación (IEI, %), según la fórmula de Santillana et al. (2012)Santillana, N., Zúñiga, D. & Arellano, C. 2012. "Capacidad promotora del crecimiento en cebada (Hordeum vulgare) y potencial antagónico de Rhizobium leguminosarum y Rhizobium etli". Agrociencia Uruguay, 16(2): 11-17, ISSN: 2301-1548. :

La figura 1 muestra las precipitaciones durante el período septiembre/2019-abril/2020. Septiembre y octubre de 2019 se caracterizaron por ser de abundantes precipitaciones. Sin embargo, en el período de diciembre de 2019 a abril de 2020 fueron muy bajas en diciembre, enero, febrero, marzo y abril. En este intervalo acontecieron importantes etapas fenológicas del cultivo, que coincidieron con un nivel muy bajo de precipitaciones.

Como evidencia la figura 2, las temperaturas promedio más altas en el período experimental ocurrieron en septiembre de 2019 y abril de 2020, meses en los que se sembró y se realizó el corte del experimento, respectivamente. Las temperaturas máximas alcanzaron sus mayores valores también en estos intervalos, mientras que las temperaturas mínimas se registraron en diciembre de 2019 y enero de 2020.

En la figura 3 se deja ver que el mayor valor de la humedad relativa se registró en octubre de 2019, mientras que el menor fue en abril de 2020. En este último se realizó el corte del experimento.

A los 15 DDS, el tratamiento INICA-8 (51.90 cm) presentó valores superiores (P < 0.001) al CA (40.30 cm) y a EcoMic^® (44.40 cm), aunque se igualó al TFMO (52.63 cm) y a EcoMic^®+INICA-8 (47.80 cm). No obstante, resultó inferior al TF P₂O₅ (62.30 cm) (figura 4).

A los 45 DDS, el TF P₂O₅ (86.12 cm), así como el TFMO (90.15 cm) fueron superiores (P < 0.001) al control absoluto (67.06 cm), mientras que mostraron letras iguales a los tres tratamientos inoculados. Estos últimos presentaron valores estadísticamente iguales entre sí y con respecto al control absoluto (figura 4).

A los 75 DDS, el TF P₂O₅ (141.40 cm) alcanzó valores superiores (P < 0.001) al resto de los tratamientos, con excepción del TFMO (119.50 cm). EcoMic^® (118.40 cm), INICA-8 (111.05 cm) y EcoMic^®+INICA-8 (97.79 cm) se igualaron estadísticamente, pero solo EcoMic^® e INICA-8 resultaron superiores al CA (figura 4).

A los 105 DDS, el TF P₂O₅ (193.90 cm) mostró valores superiores (P < 0.001) al resto de los tratamientos, mientras que EcoMic^®+INICA-8 (167.10 cm) y TFMO (158.50 cm) aunque compartieron letras comunes con INICA-8 (154.60 cm), fueron superiores a EcoMic^® (140.30 cm) y al CA (130.60 cm) (figura 4).

A los 135 DDS, el TF P₂O₅ (206.20 cm) mostró valores superiores (P < 0.001) al resto de los tratamientos, excepto para EcoMic^®+INICA-8 (190.40 cm), con el que fue estadísticamente similar. Este último, a su vez, compartió letras comunes con EcoMic^® (182.33 cm), y fue superior a INICA-8 (167.00 cm), al TFMO (164.70 cm) y al CA (156.33 cm) (figura 4).

En el momento del corte (165 DDS), EcoMic^®+INICA-8 (213.33 cm) mostró superioridad (P < 0.001) con relación a INICA-8 (186.90 cm) y al CA (174.90 cm), aunque compartió letras comunes con EcoMic^® (196.00 cm) y con el TFMO (195.90 cm), siendo solo inferior al testigo fertilizado químicamente (257.69 cm) (figura 4).

Los resultados que se obtuvieron en este experimento indican la superioridad de los tratamientos inoculados con respecto al CA en todas las etapas que se evaluaron, donde se destaca la combinación de Glomus cubense con Azospirillum en las últimas tres mediciones (105 DDS, 135 DDS y 165 DDS). Esta superioridad de los inoculantes con respecto al control en esas fases, se podría deber al efecto sinérgico de la cepa de Glomus cubense, que se aplicó en combinación con la cepa INICA-8 de Azospirillum brasilense. No obstante, también se registró efecto superior con respecto al CA por parte de cada uno de los inoculantes que se aplicaron de forma simple en las tres primeras mediciones (15 DDS, 45 DDS y 75 DDS). Sin embargo, estos tratamientos no superaron a los testigos fertilizados.

La asociación de HMA con diferentes genotipos de morera puede facilitar la absorción de nitrógeno y fósforo por parte de la planta (Ambika et al. 1994Ambika, P.K., Das, P.K., Katiyar, R.S. & Choudhury, P.C. 1994. "The influence of vesicular arbuscular mycorrhizal association on growth, yield and nutrient uptake in some mulberry genotypes (Morus spp.)". Indian Journal of Sericulture, 33: 166-169, ISSN: 0445-7722.). Asimismo, la aplicación de Azospirillum brasilense puede reducir los requerimientos de fertilizantes nitrogenados, como la urea, lo que contribuye a disminuir los costos en morera (Das et al. 1994Das, P.K., Choudhury, P.C., Ghosh, A., Katiyar, R.S., Rao, G.R.M., Mathur, V.B., Mazamder, M.K. & Madhava-Rao, Y.R. 1994. "Studies on the effect of bacterial biofertilizers in irrigated mulberry (Morus alba L.) ". Indian Journal of Sericulture, 33(2): 170, ISSN: 0445-7722.).

Sánchez de la Cruz et al. (2008)Sánchez de la Cruz, R., Díaz-Franco, A., Pecina-Quintero, V., Garza-Cano, I. & Loera-Gallardo, J. 2008. "Nota científica: Glomus intraradices y Azospirillum brasilense en trigo bajo dos regímenes de humedad en el suelo". Universidad y Ciencia, 24(3): 239-245, ISSN: 0186-2979. encontraron que en experimentos de invernadero la inoculación simple de G. intraradices, así como de A. brasilense, incrementó la altura de la planta en trigo. Sin embargo, la combinación de estos microorganismos no ejerció un efecto perceptible en las variables estudiadas, a pesar de existir un régimen de humedad regulado constante, lo que contradice lo obtenido en el presente experimento. Es posible que mecanismos asociados específicamente a la familia de plantas, y no a la sinergia de estos microorganismos, influyan en estos resultados divergentes. Shaimaa y Massoud (2017)Shaimaa, A.M. & Massoud, O.N. 2017. "Impact of Inoculation with Mycorrhiza and Azotobacter under Different N and P Rates on Growth, Nutrient status, Yield and Some Soil Characteristics of Washington Navel Orange Trees". Middle East Journal of Agriculture, 6(3): 617-638, ISSN: 2706-7955., al inocular una combinación de Azotobacter y HMA en naranja, observaron un sinergismo que se reflejó en el crecimiento de las plantas, en la extracción de N, P y K en hojas, y en el rendimiento.

En el presente experimento, la respuesta superior de las plantas a la aplicación de fertilizante químico coincide con lo informado por Baqual y Das (2006)Baqual, M.F. & Das, P.K. 2006. "Influence of Biofertilizers on Macronutrient uptake by the Mulberry Plant and its Impact on Silkworm Bioassay". Caspian Journal of Environmental Sciences, 4(2): 98-109, ISSN: 1735-3033., quienes afirman que la morera responde bien a la aplicación de fertilizante nitrogenado como fosfórico.

En la figura 5 se muestra el efecto significativamente superior del tratamiento inoculado con EcoMic^® (1.70 cm) con respecto al resto de los tratamientos (P < 0.001), aunque compartió letras comunes con el TFQ (1.60 cm). A su vez, la combinación EcoMic^®+INICA-8 (1.50 cm) fue superior a INICA-8 (1.33 cm) y al control absoluto (1.23 cm), y compartió letras comunes con los dos testigos fertilizados.

Los resultados obtenidos en esta variable indican una marcada influencia de la inoculación con HMA, en forma simple como en combinación con Azospirillum. No obstante, se destacó el tratamiento inoculado solo con HMA, lo que coincide con lo informado por Pentón et al. (2011)Pentón, G., Reynaldo, I., Martín, G.J., Rivera, R. & Oropesa, K. 2011. "Uso del EcoMic^® y el producto bioactivo Pectimorf^® en el establecimiento de dos especies forrajeras". Pastos y Forrajes, 34(3): 281-294, ISSN: 2078-8452. en un experimento con estacas de morera en vivero.

Mediante la simbiosis que se establece entre los HMA y las plantas se incrementa la absorción de algunos nutrientes de difícil movilidad en el suelo (P, Fe, entre otros), debido a la acción del micelio externo de los HMA, ligado a los sistemas radicales de las plantas, y a la mayor absorción de agua, N, K y algunos micronutrientes (Sanclemente et al. 2018Sanclemente, O.E., Sánchez de Prager, M., Prager, M. 2018. "Prácticas agroecológicas, micorrización y productividad del intercultivo maíz-soya (Zea mays L.- Glycine max L.)". Idesia (Arica), 36(2): 217-224, ISSN: 0718-3429, DOI: http://dx.doi.org/10.4067/S0718-34292018005000301.). Este tipo de ramificaciones de las raíces también beneficia la absorción de nutrientes mediante el incremento de la superficie radical (Ruiz-Lozano 2016Ruiz-Lozano, J.M., Aroca, R., Zamarreño, A.M., Molina, S., Andreo-Jiménez, B., Porcel, R., García-Mina, J.M., Ryter-Spira, C. & López-Ráez, J.A. 2016. "Arbuscular mycorrhizal symbiosis induces strigolactone biosynthesis under drought and improves drought tolerance in letuce andtomato". Plant, Cell & Environment, 39(2): 441-452, ISSN: 1365-3040, DOI: https://doi.org/10.1111/pce.12631.). Los HMA mejoran la extracción de nutrientes desde el suelo y su eficiencia (Bitterlich y Franken 2016Bitterlich, M. & Franken, P. 2016. "Connecting polyphosphate translocation and hyphal water transport points to a key of mycorrhizal functioning". The New Phytologist, 211(4): 1147-1149, ISSN: 1469-8137, Available: https://www.jstor.org/stable/newphytologist.211.4.1147.), lo que trae consigo mayores exportaciones de estos.

Padma et al. (2000)Padma, S.D., Sukumar, J. & Nagendrakumar, T.D. 2000. "Mycorrhizal association in mulberry". Bulletin of Materials Science, 4(2): 18-25, ISSN: 0250-4707. , al referirse a los hongos simbióticos micorrízicos que colonizan la corteza de las raíces de la morera, destacaron su importante función en la eficiencia de la movilización del fósforo y en la disponibilidad de un grupo de micronutrientes, así como en el crecimiento y desarrollo de las plantas.

Diversos estudios demuestran que comunidades de diversas bacterias asociadas a HMA potencian la micorrización y el crecimiento de las plantas (Agnolucci et al. 2015Agnolucci, M., Battini, F., Cristani, C. & Giovannetti, M. 2015. "Diverse bacterial communities are recruited on spores of different arbuscular mycorrhizal fungal isolates". Biology and Fertility of Soils, 51(3): 379-389, ISSN: 1432-0789, DOI: https://doi.org/10.1007/s00374-014-0989-5.). Esta interacción entre HMA-bacteria incrementa la colonización de ambos microrganismos en el hospedero, debido a que aumenta la germinación y el crecimiento de las hifas de los endófitos y se acrecienta la población de bacterias en la rizosfera de las plantas en presencia de los HMA (Fernández et al. 2016Fernández, B.L., Colombo, R., Bompadre, J., Benavides, M., Scorza, V., Silvani, V., Pergola, M. & Godeas, A. 2016. "Cultivable bacteria associated with infective propagules of arbuscular mycorrhizal fungi. Implications for mycorrhizal activity". Applied Soil Ecology, 105: 86-90, ISSN: 0929-1393, DOI: https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2016.04.013. y Long et al. 2017Long, L., Lin, Q., Yao, Q. & Zhu, H. 2017. "Population and function analysis of cultivable bacteria associated with spores of arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora margarita. 3" Biotech, 7(1): 8, ISSN: 2190-5738, DOI: https://doi.org/10.1007/s13205-017-0612-1.). No obstante, la estimulación del crecimiento de las plantas en presencia de hongos micorrízicos arbusculares no tiene que estar asociada necesariamente con la solubilización de los elementos poco móviles en el suelo o presentes a bajas concentraciones. Mecanismos como la producción de fitohormonas, vitaminas o aminoácidos pueden estar ligados a los efectos de estos microorganismos (Siqueira 2010Siqueira, J.O. 2010. Micorrizas: 30 años de pesquisas no Brasil. Ed. UFLA. Lavras, Minas Gerais, Brasil, p. 716.).

La figura 6 evidencia la superioridad significativa (P < 0.001) del tratamiento inoculado con EcoMic^®+INICA-8 (2.96) con respecto al resto, sobre todo con el CA (1.70). Los tratamientos inoculados de forma simple (EcoMic^® e INICA-8) compartieron letras comunes con el TFMO (2.42) y con el TF P₂O₅ (2.25).

La función de los microorganismos benéficos en el desarrollo de variables agroproductivas en morera se pone también de manifiesto en el número de ramas. Se conoce que Azospirillum también puede solubilizar fosfatos, lo que ofrece a la planta un importante nutriente que tiene un efecto positivo en diferentes parámetros fisiológicos (Tahir et al. 2013 Tahir, M., Mirza, M.S., Zaheer, A., Dimitrov, M.R., Smidt, H. & Hameed, S. 2013. "Isolation and identification of phosphate solubilizer Azospirillum, Bacillus and Enterobacter strains by 16SrRNA sequence analysis and their effect on growth of wheat (Triticum aestivum L.) ". Australian Journal of Crop Science, 7(9): 1284-1292, ISSN: 1835-2693. ). No obstante, en este estudio, hubo superioridad en los resultados derivados de la combinación de dicha bacteria con respecto a HMA. Según Aguirre-Medina (2008)Aguirre-Medina, F. 2008. Biofertilizantes microbianos: Antecedentes del programa y resultados de validación en México. In: La Biofertilización como Tecnología Sostenible. 1^st Ed. Díaz-Franco, A. & Mayek-Pérez, N. (eds). Ed. Plaza y Valdés, S.A. de C.V. México, D.F., México, p. 257, ISBN: 978-970-722-706-4., la combinación simultánea de rizobacterias promotoras del crecimiento y hongos micorrízicos arbusculares induce sinergismo, que se refleja en un incremento del crecimiento, del contenido de fósforo en las plantas y del rendimiento con respecto a las plantas inoculadas por separado. Abd-Alla et al. (2014)Abd-Alla, M.H., El-Enany, A.W.E., Nafady, N.A., Khalaf, D.M. & Morsy, F.M. 2014. "Synergistic interaction of Rhizobium leguminosarum bv. viciae and arbuscular mycorrhizal fungi as a plant growth promoting biofertilizers for faba bean (Vicia faba L.) in alkaline soil". Microbiological Research, 169(1): 49-58, ISSN: 1618-0623, DOI: https://doi.org/10.1016/j.micres.2013.07.007. y Bona et al. (2017)Bona, E., Cantamessa, S., Massa, N., Manassero, P., Marsano, F., Copetta, A., Lingua, G., D’Agostino, G., Gamalero, E. & Berta, G. 2017. "Arbuscular mycorrhizal fungi and plant growth-promoting pseudomonads improve yield, quality and nutritional value of tomato: a field study". Mycorrhiza, 27(1): 1-11, ISSN: 1432-1890, DOI: https://doi.org/10.1007/s00572-016-0727-y. consideran que el resultado de la simbiosis mutualista tripartita entre HMA-bacteria-hospedero es el incremento del desarrollo de la planta, ya que aumenta su capacidad para absorber más agua y nutrientes del suelo, como nitrógeno, fósforo, potasio y microelementos.

Diversos autores hacen referencia a resultados similares al del presente experimento, aunque con otros microorganismos benéficos. Nithya et al. (2011)Nithya, D., Poornima, S.M., Pazhani-Murugan, R., Gopikrishnan, V., Radhakrishnan, M., Bhivi, D. & Balagurunathan, R. 2011. "Influence of biofertilizers and irrigation systems for the growth and yield of mulberry plants". International Journal of Plant, Animal and Environmental Sciences, 1(3): 93-99, ISSN: 2231-4490. informaron que en un estudio con morera, al inocular las plantas con una bacteria fosfato solubilizadora y el hongo benéfico Aspergillus spp., se incrementó la longitud del tallo, así como el número de ramas y de hojas. Abdel-Rahman et al. (2011)Abdel-Rahman, S.S., Abdel-Kader, A.A. & Khalil, S.E. 2011. "Response of three sweet basil cultivars to inoculation with Bacillus subtilis and arbuscular mycorrhizal fungi under salt stress conditions". Nature and Science, 9(6): 93-111, ISSN: 2375-7167. encontraron que el efecto de la coinoculación de G. irradicans y Bacillus subtilis incrementó la altura y el número de ramas de tres variedades de albahaca, lo que superó a los tratamientos donde solo se inoculó cada microorganismo.

En la figura 7 se destaca la superioridad significativa (P < 0.001) del tratamiento combinado EcoMic^®+INICA-8 (10.76) con respecto al resto, con excepción del TF P₂O₅ (10.28). El testigo fertilizado con materia orgánica (9.22) fue superior a INICA-8 (6.45), al CA (6.03) y EcoMic^® (5.90). Estos tres últimos no difirieron entre sí.

En este estudio, el efecto combinado de Glomus cubense y Azospirillum brasilense fue el tratamiento inoculado que influyó de manera más significativa en los resultados de esta variable, al igualarse estadísticamente con el TFP₂O₅. Según Fernández y Rodríguez (2005)Fernández, M.T. & Rodríguez, H. 2005. "El papel de la solubilización de fósforo en los biofertilizantes microbianos". ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, 39(3): 27-34, ISSN: 0138-6204. , la micorrizosfera es la rizosfera de una planta micorrizada, y es en ella donde se producen las interacciones con microorganismos beneficiosos con funciones específicas y las interacciones con patógenos. En muchos casos, las interacciones establecidas son de tipo positivo, en las que se llega a registrar un efecto de sinergismo, donde la presencia de los HMA y del otro microorganismo produce incremento del crecimiento, vigor y protección de la planta.

También se sabe que la disponibilidad de P en los suelos es importante para la absorción de nitrógeno y su utilización en plantas (Vafadar et al. 2014Vafadar, F., Amooaghaie, R. & Otroshy, M. 2014. "Effects of plant-growth-promoting rhizobacteria and arbuscular mycorrhizal fungus on plant growth, stevioside, NPK, and chlorophyll content of Stevia rebaudiana". Journal of Plant Interactions, 9(1): 128-136, ISSN: , DOI: https://doi.org/10.1080/17429145.2013.779035.). Por lo tanto, más P disponible debido a su solubilización por los HMA inoculados podría conducir a una mejor absorción de N o fijación de nitrógeno por Azospirillum, lo que conllevaría a un incremento de los valores en sus variables como en el número de hojas. La coinoculación HMA-Azospirillum sp es un ejemplo de interacción benéfica, ya que la colonización de las raíces por los hongos estimula el flujo de carbohidratos desde el follaje hasta la raíz, los que pueden constituir fuentes de carbono para el crecimiento de la bacteria (Costacurta 1995Costacurta, A. 1995. "Genetic studies on the auxin hypothesis in the Azospirillum/plant inoculation". Dissertationes de Agricultura, 275: 34-39, ISSN: 0772-1285. ).

En la figura 8 se deja ver que tanto EcoMic^®+INICA-8 (78.51g/planta) como el TFMO (76.79 g/planta) fueron superiores al resto de los tratamientos de forma significativa (P < 0.001) y estadísticamente similares entre sí. El TF P₂O₅ (64.97 g/planta) fue superior a EcoMic^® (36.60 g/planta), al control absoluto (30.10 g/planta) y al INICA-8 (29.02 g/planta).

En este experimento, el PSH es la variable de mayor importancia desde el punto de vista agronómico, pues constituye la base del potencial de producción de forraje de morera. Sudhakar et al. (2000)Sudhakar, P., Chattopadhyay, G.N., Gangwar, S.K. & Ghosh, J. K. 2000. "Effect of foliar application of Azotobacter, Azospririllum and Beijerinkia on leaf yield and quality of mulberry (Morus alba) ". The Journal of Agricultural Science, 134(2): 227-234, ISSN: 1469-5146, DOI: https://doi.org/10.1017/S0021859699007376. informaron acerca de las ventajas de la aplicación de biofertilizantes bacterianos en la producción de hojas en este cultivo. Baqual y Qayoom (2004)Baqual, M.F. & Qayoom, S. 2004. "Biofertilizers and promises that they bold". Indian Silk, 43(3): 15-16, ISSN: 0019-6355., al aplicar indistintamente Azotobacter y Azospirillum a plantas de morera, observaron incremento en la produccción de hojas y otras variables. No obstante, en este trabajo, solo la combinación de Glomus cubense y A. brasilense propició superior peso seco de las hojas, con valores similares al de la aplicación de fertilizante orgánico. Por lo tanto, es evidente que la acción sinérgica de ambos microorganismos, aumentó el número de hojas y otras variables aquí estudiadas.

La marcada diferencia entre los tratamientos en los que se combinan las HMA y Azospirillum con el control se pudo deber a la cantidad de P absorbido por las plantas por el efecto de las HMA aplicadas. Esta hipótesis se fundamenta por diferentes autores que corroboran que las micorrizas toman los fosfatos en el suelo de forma más eficiente mediante sus hifas que incrementan el volumen de suelo explorado (Smith et al. 2011Smith, S.E., Jakobsen, I., Gronlund, M. & Smith, F.A. 2011. "Roles of arbuscular mycorrhizas in plant phosphorus nutrition: interactions between pathways of phosphorus uptake in arbuscular mycorrhizal roots have important implications for understanding and manipulating plant phosphorus acquisition". Plant Physiology, 156(3): 1050-1057, ISSN: 1532-2548, DOI: https://doi.org/10.1104/pp.111.174581.). Valerio (2016)Valerio, S.D. 2016. Respuesta morfofisiológica y expresión de genes Pht1 de cuatro cultivares de Zea mays L., inoculados con hongos micorrízicos arbusculares bajo dos concentraciones de fósforo inorgánico. MSc. Thesis. La Paz, Baja California Sur, México, p. 101. confirmó que la inoculación de maíz con Claroideo glomus etunicatum conlleva al aumento significativo del área foliar y del peso seco de las hojas.

Umakanth y Bagyaraj (1998)Umakanth, C.G. & Bagyaraj, D.J. 1998. "Response of mulberry saplings to inoculation with VA Mycorrhizal Fungi and Azotobacter". Sericologia, 38(4): 669-675, ISSN: 0250-3980. observaron que la inoculación doble de morera S34 en vivero (adecuada para áreas de secano) con Glomus fasciculatum y la bacteria diazotrófica Azotobacter chroococcum condujo al aumento considerable del crecimiento y desarrollo de las plantas. Según Bellone y de Bellone (2012)Bellone C.H. & de Bellone, S.C. 2012. "Interaction of Azospirillum brasilense and Glomus intrarradix in Sugar Cane Roots". Indian Journal of Microbiology, 52(1): 70-75, ISSN: 0973-7715, DOI: https://doi.org/10.1007/s12088-011-0208-0., la combinación con Glomus y Azospirillum ayuda a la caña de azúcar a mejorar la disponibilidad de nitrógeno y la absorción en las plantas, lo que incrementa su biomasa.

De acuerdo con Ram Rao et al. (2007)Ram-Rao, D.M., Kodandaramaiah, J., Reddy, M.P., Katiyar, R.S. & Rahmathulla, V.K. 2007. "Effect of VAM fungi and bacterial biofertilizers on mulberry leaf quality and silkworm cocoon characters under semiarid conditions". Caspian Journal of Environmental Sciences, 5(2): 111-117, ISSN: 1735-3033., la inoculación combinada de G. mosseae con A. chroococcum en morera demostró su efecto superior desde el punto de vista agronómico y económico, con el mejoramiento de la fertilidad del suelo, la calidad de las hojas, entre otras variables. Vafadar et al. (2014)Vafadar, F., Amooaghaie, R. & Otroshy, M. 2014. "Effects of plant-growth-promoting rhizobacteria and arbuscular mycorrhizal fungus on plant growth, stevioside, NPK, and chlorophyll content of Stevia rebaudiana". Journal of Plant Interactions, 9(1): 128-136, ISSN: , DOI: https://doi.org/10.1080/17429145.2013.779035. informaron que la inoculación dual de G. intraradices y A. chroococcum aumentó el peso seco de las hojas de Stevia rebaudiana. Según estos autores, la capacidad de las HMA de solubilizar fósforo en las raíces le asegura a la bacteria una continua fijación del nitrógeno atmosférico, proceso que pudiera ser una de las causas de los resultados obtenidos en este experimento.

Se destaca aquí el efecto superior de la fertilización orgánica en esta variable. Este resultado contradice lo informado por Bello et al. (2011)Bello, R., García, M., Martínez, V. & Abeledo, C. 2011. "Effect of two organic fertilizers on the cultivation of mulberry (Morus alba) trees". Revista Computadorizada de Producción Porcina, 18(3): 203-206, ISSN: 1026-9053. acerca de que la aplicación de fuentes orgánicas no siempre causa beneficio al cultivo de morera, especialmente cuando se usa compost de mala calidad. Esto pudiera indicar que la materia orgánica utilizada en el presente experimento es de gran calidad.

En la figura 9 se demuestra que el IEI que predominó en esta variable fue el que se obtuvo en la inoculación combinada de EcoMic^®+INICA-8 (160.8%), mientras que la inoculación con EcoMic^® resultó menor, pero con valores positivos (21.98 %). Además, la aplicación simple de INICA-8 no fue eficiente.

Por los resultados del cálculo de la eficiencia en la inoculación se puede ver un mayor efecto de la combinación de los microorganismos aplicados. La aplicación simple de Glomus cubense, y sobre todo, la de Azospirillum brasilense, no ejerció un efecto positivo en el peso de las hojas. Esta ineficiencia de Azospirillum se pudiera deber a factores antagonistas que pudieron afectar la superviviencia de la bacteria o su capacidad como PGPR. Entre estos factores se encuentran las condiciones físico-químicas del suelo, el genotipo del hospedante y la capacidad de la bacteria para su establecimiento y para competir con la microflora nativa (Pecina-Quintero et al. 2005Pecina-Quintero, V., Díaz-Franco, A., Williams-Alanís, H., Rosales-Robles, E. & Garza-Cano, I. 2005. "Influencia de fecha de siembra y biofertilizantes en sorgo". Revista Fitotecnia Mexicana, 28(4): 389-392, ISSN: 0187-7380. ).

La interacción entre HMA y las bacterias incrementa las poblaciones de ambos microorganismos en la rizosfera de las plantas, lo que estimula un incremento en el volumen de raíces. Esto permite mayor absorción de agua y nutrientes, además de aumentar la solubilización de fósforo, la fijación de nitrógeno y la inducción de resistencia. Además, se mejora la tolerancia a factores abióticos, entre otros (Meng et al. 2015Meng, L., Zhang, A., Wang, F., Han, X., Wang, D. & Li, S. 2015. "Arbuscular mycorrhizal fungi and rhizobium facilitate nitrogen uptake and transfer in soybean/maize intercropping system". Frontiers in Plant Science, 6: 1-10, ISSN: 1664-462X, DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2015.00339.). Bécquer et al. (2019)Bécquer, C.J., Reyes, R., Fernández, D., González, P.J. & Medinilla, F. 2019. "Rendimiento de pasto Mulato II inoculado con Bradyrhizobium sp. y Glomus cubense, en condiciones de sequía agrícola". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(3): 319-330, ISSN: 2079-3480. refirieron que la inoculación combinada de G. cubense y Bradyrhizobium sp. en el pasto mulato II derivó en un IEI de la biomasa aérea superior al obtenido con las demás formas de inoculación simple de estos microorganismos.

Se concluye que la inoculación combinada de EcoMic^®+INICA-8 ejerció un efecto superior en las variables estudiadas. Las variables que más se favorecieron con la inoculación fueron la longitud del tallo y el número de ramas. La inoculación simple de INICA-8 fue ineficiente en todas las variables.

Se recomienda evaluar los tratamientos seleccionados en otros ensayos de campo con Morus alba en diferentes condiciones edafoclimáticas y en varios cortes, así como evaluar la inclusión de diferentes niveles de materia orgánica en las combinaciones de inoculantes en Morus alba.