The purposes of this study were i) to determine the total fungal contamination in Sicilian raw materials and livestock, ii) to evaluate the occurrence of
Fungal contamination in food and feed cause significant economic losses in primary agricultural yields, in the transforming industries and in livestock farms (
The cellulolytic activity is widely distributed in the contaminating fungi belonging to Phylum Ascomycota as in the genera Bulgaria, Chaetomium, Helotium, Neurospora, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium and Trichoderma (Lynd et al. 2002 and
Among these, species belonging to the genus Aspergillus are able to produce a large variety of glucanases that allow the complete degradation of cellulose.
Moreover, species belonging to genera Aspergillus, Fusarium and Penicillium, able to produce dangerous mycotoxins, can cause metabolic disorders resulting in biological effects on animals as liver and kidney toxicity, central nervous system effects and estrogenic effects (
In particular, the contamination of feeds with fungi and their spores is worldwide described. In tropical regions
The aim of this study was to evaluate, in Sicilian raw materials and livestock feeds, the total fungal contamination and to detect the percentage of the three potential mycotoxigenic genera (Aspergillus, Fusarium and Penicillium). Moreover, the most recurrent Aspergillus isolates, identified at level of specie by morphological and molecular methodologies, was tested to evaluate their cellulolytic activity.
Code
Sample
Composition
Sampling area
1
Flaked broad bean
Raw material
Packaging area
2
Oat
Raw material
3
Poultry feed
Soy flour, cornmeal, maize, wheat bran
4
Flaked maize
Raw material
5
Swine feed
Maize, wheat bran, barley, sunflower flour, carob, citrus peel
6
Horses feed (West Performance)
Wheat bran, broad bean, flaked barley, carobs, maize, oat flour, molasses
7
Cattle feed
Maize, barley, carobs, broad bean
8
Poultry feed
Soy, corn, wheat bran, maize
Finished product storage area
9
Horses feed (West Performance)
Wheat bran, broad bean, flaked barley, carobs, maize, oat flour, molasses
10
Flacked broad bean
Raw material
11
Cattle feed
Maize, barley, carobs, broad bean
12
Flaked maize
Raw material
13
Horses feed (Superior House)
Flaked broad bean, flaked maize, flaked barley, flaked oat, flaked corn, sunflower flour
14
Ruminants feed
Broad bean, barley flour, maize, wheat bran
PCR products were separated by electrophoresis in 1% agarose gel and amplicons were detected under UV transilluminator (330 nm).
PCR products were purified using Exo I-SAP protocol according to the manufacturer’s instructions (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primer ITS1F was used in the sequencing reaction. Sequencing reactions were performed with BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) followed by Ethanol/EDTA/Sodium Acetate precipitation (according to manufacturer’s instruction). Finally, capillary electrophoresis was performed in the 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). The sequences were aligned against those already deposited in the GenBank databases using BLASTn tool (
abcdIn each column, values followed by same letters are not statistically different according to Fisher LSD Test (P≤0.05).
SAMPLE
PDA
%Aspergillus
SAB
%Aspergillus
1= Flaked broad bean
6.37 + 2.28 a
0
5.05 + 1.84 ab
0
2= Oat
8.12 + 0.39 c
25
5.20 + 0,30 ab
59
3= Poultry feed
7.88 + 0,40 abc
0
5.48 + 0.22 ab
0
4= Flaked maize
7.37 + 0.46 ab
36
5.09 + 1.85 ab
0
5= Swine feed
7.46 + 0.41 ab
31
5.94 + 0.08 bc
3
6= Horses feed
8.01 + 0.88 bc
0
5.05 + 1.74ab
0
(West Performance)
7= Cattle feed
7.91 + 0.17 bc
18
4.43 + 0.09 a
8
8= Poultry feed
7.85 + 0.14 abc
14
6.20 + 0.26 c
1.33
9= Horses feed
7.65 + 0.09 ab
20
5.12 + 0.52 ab
70
(West Performance)
10= Flacked broad bean
7.05 + 2.50 a
0
5.05 + 1.63ab
66
11= Cattle feed
6.05 + 2.17 a
0
3.05 + 1.17a
0
12= Flaked maize
7.15 + 0.59 a
0
3.52 + 1.22a
0
13= Horses feed
7.35 + 0.66 ab
0
3.74 + 1.30 a
60
(Superior House)
14= Ruminants feed
7.35 + 2.50 ab
0
4.60 + 1.54a
0
An amplicon from about 500 to 600 bp of the ribosomal region including the two non-coding ITS1 and ITS2, and the 5.8S rDNA gene was amplified from 8 Aspergillusspp. isolates.
Isolates
Feed samples
Colour on PDA
Colony growth at 25°C (mm)
Stage
Conidiophores
Conidia shape
Conidia size (µm)
Vesicle size (µm)
Hulle’s cell
Species
GenBank Accession number
PDA
SAB
CZ
ITS
SAAF 7
5
Black
55x57
60x65
66x67
A
Biseriate
Rough
4.6-5.7
55-70
-
MK503962
SAAF 12
8
Black
83x83
85x85
85x85
A
Biseriate
Rough
4.5-6
25-40
-
MK503964
SAAF 15
9
Black
79x81
80x82
83x84
A
Biseriate
Rough
4.6-5.8
30-45
-
MK503966
SAAF 14
7
Dark-brown
35x36
32x33
45x47
A
Biseriate
Smooth
3.5-4.1
20-40
-
MK503965
SAAF 10
12
Black
80x80
85x85
85x85
A
Biseriate
Smooth
4-6
40-50
-
MK503963
SAAF 4
7
Green
67x70
75x75
83x83
A
Biseriate
Smooth -finely rough
3.2-5.8
18-36
-
MK503960
SAAF 17
10
Yellow-green
75x75
80x80
75x75
A
Biseriate
Smooth
5.3-7.2
25-40
-
MK503967
SAAF 6
2
Yellow
25x25
25x25
30x30
T
Uniseriate
Rough
4.3-6.5
20-25
+
MK503961
Strains
25 ºC S
30 ºC S
30 ºC Sh
5
10
15
21
5
10
15
21
5
10
15
21
1
1
2
3
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
2
2
1
1
1
2
1
2
3
5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
0
1
3
5
1
1
3
5
1
1
1
1
1
3
4
5
1
1
3
5
1
2
3
4
1
1
2
2
0
1
2
4
1
1
1
1
1
2
2
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
2
4
In this study, for the first time, fourteen feed samples collected in two sampling area in a mill in Sicily were monitored to detect the presence of contaminating fungi. The level of fungal contaminations in all feed samples ranged from about 3 to 8 Log CFU/g with the recurrent presence of colonies belonging mostly to the ubiquitarious genera Aspergillus, Fusarium and Penicillium, the main toxigenic molds. Between them Fusarium was the predominant genus isolated from samples, followed by Aspergillus and Penicillium, according with the results of other studies conducted in Italy and Europe (
Usually, the population of these fungal contaminants in feed and food is strictly related to the relative concentrations in mycotoxins, in particular in bad-stored or long-exported materials (
Among the contaminating fungi, some species within the genus Aspergillus are the most critical for their mycotoxigenic and cellulolytic activity, causing a potential risk for animal and human health and for the degradation of trophic substance (
As presented in the results, the highest cellulolytic activity is shown in the Aspergillus species that are part of the "Nigri section", in this case
On the other hand, once the microorganisms have secreted their enzymes into the media, the enzymatic activity is conditioned by different factors such as pH, ionic strength, temperature, among others (
In regard to the mycotoxigenic activity (not evaluated in this study), among the six identified Aspergillus species,
This first study on the evaluation of the level of fungal contamination in Sicilian raw materials and livestock showed the presence of
On the basis of these results it is assumed that the most contaminated feed by these fungi can be the most degraded from a nutritional point of view.
This study highlights the importance of continued monitoring and control of fungal contamination in feed and food. Strategies aimed to prevent them in field, during storage and in all the feed production chain should be implemented. The control of this fungal contaminants and corrects techniques of animal feed production, in fact, can assure not only high level of animal’s health but also high quality level of feeds both in palatability and nutritional values.
Los objetivos de este estudio fueron: 1) determinar la contaminación fúngica total en materias primas y ganado sicilianos, 2) evaluar la aparición de
La contaminación fúngica en alimentos y piensos causa importantes pérdidas económicas en los rendimientos agrícolas primarios, en las industrias transformadoras y en las explotaciones ganaderas (
La actividad celulolítica está ampliamente distribuida en los hongos contaminantes pertenecientes al Tipo Ascomycota, como en los géneros Bulgaria, Chaetomium, Helotium, Neurospora, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium y Trichoderma (Lynd
Entre estas, las especies que pertenecen al género Aspergillus son capaces de producir una gran variedad de glucanasas que permiten la degradación completa de la celulosa.
Además, las especies que pertenecen a los géneros Aspergillus, Fusarium y Penicillium, capaces de producir micotoxinas peligrosas, pueden causar trastornos metabólicos que producen efectos biológicos en animales como toxicidad hepática y renal, efectos en el sistema nervioso central y efectos estrogénicos (
En particular, la contaminación de los piensos con hongos y sus esporas se describe en todo el mundo. En las regiones tropicales
El objetivo de este estudio fue evaluar, en las materias primas sicilianas y los piensos para ganado, la contaminación fúngica total y detectar el porcentaje de los tres géneros micotoxigénicos potenciales (Aspergillus, Fusarium y Penicillium). Además, los aislados de Aspergillus más recurrentes, identificados a nivel de especie mediante metodologías morfológicas y moleculares, se analizaron para evaluar su actividad celulolítica.
Code
Sample
Composition
Sampling area
1
Flaked broad bean
Raw material
Packaging area
2
Oat
Raw material
3
Poultry feed
Soy flour, cornmeal, maize, wheat bran
4
Flaked maize
Raw material
5
Swine feed
Maize, wheat bran, barley, sunflower flour, carob, citrus peel
6
Horses feed (West Performance)
Wheat bran, broad bean, flaked barley, carobs, maize, oat flour, molasses
7
Cattle feed
Maize, barley, carobs, broad bean
8
Poultry feed
Soy, corn, wheat bran, maize
Finished product storage area
9
Horses feed (West Performance)
Wheat bran, broad bean, flaked barley, carobs, maize, oat flour, molasses
10
Flacked broad bean
Raw material
11
Cattle feed
Maize, barley, carobs, broad bean
12
Flaked maize
Raw material
13
Horses feed (Superior House)
Flaked broad bean, flaked maize, flaked barley, flaked oat, flaked corn, sunflower flour
14
Ruminants feed
Broad bean, barley flour, maize, wheat bran
Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se detectaron amplicones bajo transiluminador UV (330 nm).
Los productos de PCR se purificaron utilizando el protocolo Exo I-SAP de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). El cebador ITS1F se usó en la reacción de secuenciación. Las reacciones de secuenciación se realizaron con BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) seguido de precipitación con etanol/EDTA/acetato de sodio (según las instrucciones del fabricante). Finalmente, la electroforesis capilar se realizó en el analizador genético 3500 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias se alinearon contra las ya depositadas en las bases de datos GenBank utilizando la herramienta BLASTn (
abcdIn each column, values followed by same letters are not statistically different according to Fisher LSD Test (P≤0.05).
SAMPLE
PDA
%Aspergillus
SAB
%Aspergillus
1= Flaked broad bean
6.37 + 2.28 a
0
5.05 + 1.84 ab
0
2= Oat
8.12 + 0.39 c
25
5.20 + 0,30 ab
59
3= Poultry feed
7.88 + 0,40 abc
0
5.48 + 0.22 ab
0
4= Flaked maize
7.37 + 0.46 ab
36
5.09 + 1.85 ab
0
5= Swine feed
7.46 + 0.41 ab
31
5.94 + 0.08 bc
3
6= Horses feed
8.01 + 0.88 bc
0
5.05 + 1.74ab
0
(West Performance)
7= Cattle feed
7.91 + 0.17 bc
18
4.43 + 0.09 a
8
8= Poultry feed
7.85 + 0.14 abc
14
6.20 + 0.26 c
1.33
9= Horses feed
7.65 + 0.09 ab
20
5.12 + 0.52 ab
70
(West Performance)
10= Flacked broad bean
7.05 + 2.50 a
0
5.05 + 1.63ab
66
11= Cattle feed
6.05 + 2.17 a
0
3.05 + 1.17a
0
12= Flaked maize
7.15 + 0.59 a
0
3.52 + 1.22a
0
13= Horses feed
7.35 + 0.66 ab
0
3.74 + 1.30 a
60
(Superior House)
14= Ruminants feed
7.35 + 2.50 ab
0
4.60 + 1.54a
0
Un amplicón de aproximadamente 500 a 600 pb de la región ribosómica, que incluye los dos ITS1 e ITS2 no codificantes, y el gen de ADNr 5.8S se amplificó a partir de 8 aislados de
Isolates
Feed samples
Colour on PDA
Colony growth at 25°C (mm)
Stage
Conidiophores
Conidia shape
Conidia size (µm)
Vesicle size (µm)
Hulle’s cell
Species
GenBank Accession number
PDA
SAB
CZ
ITS
SAAF 7
5
Black
55x57
60x65
66x67
A
Biseriate
Rough
4.6-5.7
55-70
-
MK503962
SAAF 12
8
Black
83x83
85x85
85x85
A
Biseriate
Rough
4.5-6
25-40
-
MK503964
SAAF 15
9
Black
79x81
80x82
83x84
A
Biseriate
Rough
4.6-5.8
30-45
-
MK503966
SAAF 14
7
Dark-brown
35x36
32x33
45x47
A
Biseriate
Smooth
3.5-4.1
20-40
-
MK503965
SAAF 10
12
Black
80x80
85x85
85x85
A
Biseriate
Smooth
4-6
40-50
-
MK503963
SAAF 4
7
Green
67x70
75x75
83x83
A
Biseriate
Smooth -finely rough
3.2-5.8
18-36
-
MK503960
SAAF 17
10
Yellow-green
75x75
80x80
75x75
A
Biseriate
Smooth
5.3-7.2
25-40
-
MK503967
SAAF 6
2
Yellow
25x25
25x25
30x30
T
Uniseriate
Rough
4.3-6.5
20-25
+
MK503961
Strains
25 ºC S
30 ºC S
30 ºC Sh
5
10
15
21
5
10
15
21
5
10
15
21
1
1
2
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0
0
0
0
0
0
0
1
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2
2
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1
1
2
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2
3
5
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
0
1
3
5
1
1
3
5
1
1
1
1
1
3
4
5
1
1
3
5
1
2
3
4
1
1
2
2
0
1
2
4
1
1
1
1
1
2
2
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
2
4
En este estudio, por primera vez, se monitorearon catorce muestras de pienso recolectadas en dos áreas de muestreo en un molino en Sicilia para detectar la presencia de hongos contaminantes. El nivel de contaminaciones fúngicas en todas las muestras de pienso varió de aproximadamente de 3 a 8 Log CFU/g con la presencia recurrente de colonias que pertenecen principalmente a los géneros ubicuos Aspergillus, Fusarium y Penicillium, los principales mohos toxigénicos. Entre ellos, Fusarium fue el género predominante aislado de las muestras, seguido de Aspergillus y Penicillium, de acuerdo con los resultados de otros estudios realizados en Italia y Europa (
Por lo general, la población de estos contaminantes fúngicos en piensos y alimentos está estrictamente relacionada con las concentraciones relativas en micotoxinas, en particular en materiales mal almacenados o exportados durante mucho tiempo (
Entre los hongos contaminantes, algunas especies dentro del género Aspergillus son las más críticas por su actividad micotoxigénica y celulolítica, causando un riesgo potencial para la salud animal y humana y para la degradación de la sustancia trófica (
Como se presenta en los resultados, la mayor actividad celulolítica se muestra en las especies de Aspergillus que forman parte de la "sección Nigri", en este caso
Por otra parte, una vez que los microorganismos han secretado sus enzimas en los medios, la actividad enzimática está condicionada por diferentes factores como el pH, la fuerza iónica, la temperatura, entre otros (
Con respecto al efecto de la agitación, se observa que al final de los 21 días de experimentación, todas las cepas con agitación, excepto en el caso de
Con respecto a la actividad micotoxigénica (no evaluada en este estudio), entre las seis especies de Aspergillus identificadas,
Aunque la detección de hongos toxigénicos en las muestras analizadas no necesariamente indica que las micotoxinas se producen naturalmente en el pienso, estas alertan sobre el riesgo potencial de contaminación. Otras especies aisladas de muestras de piensos, como
Este primer estudio sobre la evaluación del nivel de contaminación por hongos en las materias primas y ganado sicilianos mostró la presencia de
Sobre la base de estos resultados, se supone que el pienso más contaminado por estos hongos puede ser el más degradado desde el punto de vista nutricional.
Esta investigación resalta la importancia de un monitoreo y control continuo de la contaminación por hongos en los alimentos y piensos. Deben implementarse estrategias destinadas a prevenirlos en el campo, durante el almacenamiento y en toda la cadena de producción de piensos. El control de estos contaminantes fúngicos y corregir las técnicas de producción de piensos para animales, de hecho, puede asegurar no solo alto nivel de salud del animal sino también alto nivel de calidad de los piensos, tanto en palatabilidad como en valores nutricionales.